劉淑敏， 許云敏， 牛 敏， 陳瑞春， 杜 艷

·論著·

急診重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的分子流行特征

劉淑敏， 許云敏， 牛 敏， 陳瑞春， 杜 艷

目的 了解急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的分子流行特征，為臨床抗感染及合理用藥提供依據(jù)。方法 收集2011年12月—2014年10月入住EICU患者送檢標(biāo)本且經(jīng)VITEK 2鑒定為CRE，進(jìn)行改良Hodge試驗、金屬酶和超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBL)表型確證試驗，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測CRE菌株攜帶的耐藥基因，通過腸桿菌基因間重復(fù)序列-PCR(ERIC-PCR)技術(shù)進(jìn)行同源性分析，明確EICU是否存在克隆株的流行。結(jié)果 ①EICU分離的CRE菌株高產(chǎn)碳青霉烯酶和ESBL，改良Hodge試驗、金屬酶和ESBL表型確證試驗陽性率分別為96%、13%和52%，其中以KPC-2、TEM和SHV為主，各自攜帶率分別為86%、86%和96%。②從2株耐碳青霉烯類的大腸埃希菌和1株陰溝腸桿菌中分離出較少見的B類碳青霉烯酶耐藥基因NDM-1。③ERIC-PCR分析表明 EICU分離的CRE菌株中48株肺炎克雷伯菌的電泳圖譜相同，3株大腸埃希菌和1株陰溝腸桿菌的電泳條帶各不相同。結(jié)論 EICU中分離的CRE高產(chǎn)碳青霉烯酶和ESBL，且為同一克隆菌株播散，表明該院耐藥形勢嚴(yán)峻，積極的預(yù)防和抗感染勢在必行。

重癥監(jiān)護(hù)病房； 碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌； 同源性

急診重癥監(jiān)護(hù)病房 (emergency intensive care unit, EICU) 是醫(yī)院感染的高發(fā)科室，由于人員流動性大、患者病因復(fù)雜、病情危重，高效廣譜抗菌藥物使用率高和多接受過有創(chuàng)治療等，給臨床抗感染帶來一定困難。有資料表明在EICU發(fā)生的感染中以革蘭陰性桿菌居多，其中以腸桿菌科細(xì)菌常見。針對此類感染臨床以碳青霉烯類抗生素作為最后一道防線，但隨著其使用率的增加，菌株發(fā)生相應(yīng)變異導(dǎo)致了碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem resistantEnterobacteriaceae，CRE)的產(chǎn)生，這不僅很大程度上限制了EICU患者的用藥，使其危重病情不能及時有效緩解，同時也給臨床治療帶來很大壓力。本文旨在通過對EICU CRE的分子特征進(jìn)行分析，為臨床抗感染提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 收集我院2011年12月—2014年10月EICU送檢的臨床非重復(fù)標(biāo)本，標(biāo)本來源主要有尿液、痰、引流液、血液和胸腹水。

1.1.2 培養(yǎng)皿 哥倫比亞血瓊脂平皿、麥康凱平皿和MH藥敏平皿均購自鄭州安圖生物技術(shù)公司。

1.1.3 鑒定卡、藥敏卡和藥敏紙片 鑒定GN卡和藥敏GN14卡購自法國生物梅里埃公司， 亞胺培南、美羅培南和厄他培南紙片均購自英國OXOID公司，EDTA紙片購自杭州天和微生物公司。用VITEK 2系統(tǒng)對 52株細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定、藥敏試驗，部分藥敏試驗采用K-B法進(jìn)行，主要藥敏紙片包括：頭孢唑林、四環(huán)素、頭孢曲松、左氧氟沙星、氨曲南、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素、磷霉素、阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、厄他培南。

1.1.4 試劑 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增所用的引物見表1，PCR所用試劑均購自TIANGEN(北京)科技有限公司。

表1 引物序列及相關(guān)文獻(xiàn)

1.1.5 儀器 Bact/ALERT全自動血培養(yǎng)儀和VITEK 2全自動微生物鑒定與藥敏分析儀購自法國生物梅里埃公司，CO2培養(yǎng)箱購自昆明友寧科技公司，1G603二級A2生物安全柜購自美國Baker公司， SW-CJ-1F超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備公司，MyCyclerTM thermalCycler DNA擴增儀及用于電泳的power pac3000型電泳儀和50×TAE buffer由 美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，凝膠成像系統(tǒng)(imageQuant LAT500)由美國GE公司生產(chǎn)。

1.1.6 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853；藥敏結(jié)果判斷參照2013年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

(1)厘清尾礦資源屬性，摸清尾礦資源家底。亟待對全國礦山尾礦資源進(jìn)行調(diào)查評價，查清固體廢棄物的堆存量、堆存位置、礦物組成和化學(xué)組成等綜合利用特征；建立全國礦山尾礦數(shù)據(jù)庫，為尾礦的綜合利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1.2.1 表型確證試驗

1.2.1.1 碳青霉烯酶和超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBL)表型確證試驗 嚴(yán)格按照2013年CLSI推薦方法進(jìn)行。對52株分離自EICU的CRE菌株分別進(jìn)行耐藥表型確證試驗，包括改良Hodge試驗、金屬酶(MBL)和ESBL的表型確證試驗；其中改良Hodge試驗曾被推薦為碳青霉烯酶表型確證試驗，EDTA協(xié)同試驗用于MBL的確證，ESBL表型確證試驗用于檢測ESBL。

1.2.1.2 PCR擴增CRE菌株的耐藥基因 煮沸裂解法提取細(xì)菌DNA，擴增的碳青霉烯酶基因包括blaKPC、blaSME、blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaOXA-48，擴增的β內(nèi)酰胺酶基因包括blaTEM、blaSHV、blaCTX-M。引物由Invitrogen公司合成，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果顯示陽性的擴增產(chǎn)物送Invitrogen公司做測序分析。

1.2.1.3 EICU分離的CRE菌株同源性分析 采用重復(fù)序列PCR (Rep-PCR)的方法，對分離菌株基因組DNA分子進(jìn)行分型，探討菌株間的同源性。設(shè)計引物(ERIC2 5＇-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′)[7],反應(yīng)體系為50 μL，包括2×TaqPCR Master MIX 25 μL, 25 mmol/L MgCl22 μL,ddH2O 20.5 μL, DNA模板2 μL，引物0.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性 1 min,40 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán); 最終延伸72 ℃ 8 min。擴增產(chǎn)物 在 1.5 %瓊脂糖凝膠中120 V電泳35 min ，電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像儀下拍照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)以擴增條帶位置完全相同為同一基因型,主條帶位置相同，副帶相差 1～2條者為亞型，不符合上述條件者為不同基因型[8]。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布及藥敏結(jié)果

共收集52株來自EICU的CRE菌株，其中肺炎克雷伯菌48株、大腸埃希菌3株、陰溝腸桿菌1株。標(biāo)本來源以呼吸道痰液居多，占61.5%，其次為尿液、血液、胸腹水和引流液。藥敏結(jié)果顯示對頭孢菌素類及含酶抑制劑耐藥率均為100%，對碳青霉烯類耐藥率均>85%。見表2。

表2 52株CRE菌株對常用抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果

2.2 耐藥表型及基因分型結(jié)果

本研究中50株菌改良Hodge試驗陽性(圖1A)，6株MBL確證試驗陽性(圖1B)，45株KPC-2陽性(圖2A)，且改良Hodge試驗同時陽性，其中44株為肺炎克雷伯菌，1株為陰溝腸桿菌；MBL基因型陽性率很低，2株肺炎克雷伯菌IMP陽性，2株大腸埃希菌和1株陰溝腸桿菌經(jīng)測序NDM-1陽性(圖2B)；另外，ESBL相應(yīng)基因型陽性率較高，以SHV和TEM為主，CTX-M僅13%為陽性，而ESBL表型陽性率稍低，可能是由于攜帶多種不同的基因型而掩蓋其本身的耐藥表型。

ERIC-PCR是利用細(xì)菌基因組中廣泛分布的短小、高度保守且重復(fù)的序列為模板,經(jīng)PCR擴增出多態(tài)性的DNA圖譜，結(jié)果可靠,是目前常用的簡便、快速的基因分型技術(shù)。本研究分離自EICU的52株CRE菌，經(jīng)電泳圖譜比對發(fā)現(xiàn)47株肺炎克雷伯菌為相同克隆菌株，1株肺炎克雷伯菌肺炎亞種與其他相差2條條帶，可能為不同亞型，1株陰溝腸桿菌為不同的條帶，3株大腸埃希菌各為不同的克隆菌株。

圖1 (A)改良Hodge試驗；(B)EDTA協(xié)同試驗陽性

A. Lane M: DNA Marker; Lane 1: positive control; Lane 2: negative control; Lane 3: negative bacteria; Lanes 4-12: positive bacteria.

B. Lane M: DNA Marker; Lane 1: NDM-1 negative control; Lane 2: positive control; Lane 3: negative bacteria; Lanes 4-6: positive bacteria; Lanes 7-8: IMP positive bacteria; Lane 9: negative control; Lane 10: positive control; Lane 11: negative bacteria.

圖2 (A)KPC-2(920 bp)電泳圖；(B)NDM-1(475 bp)和IMP(587 bp)電泳圖

Figure 2 Electrophoretogram of KPC-2 (920 bp) (A), as well as NDM-1 (475 bp) and IMP (587 bp) genes (B)

3 討論

由于ICU收治的多為病情危重患者、大多存在侵襲性操作且科室環(huán)境復(fù)雜，所以醫(yī)院感染發(fā)生率較普通病房高出3～18倍[9]。資料表明醫(yī)院感染50%以上發(fā)生在ICU，其病原菌以革蘭陰性桿菌為主[10]。碳青霉烯類抗生素曾是治療革蘭陰性桿菌感染最有效的藥物，但隨著此類抗生素在臨床上廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥現(xiàn)象在腸桿菌科細(xì)菌中呈逐漸增高趨勢，以肺炎克雷伯菌尤為明顯。本研究CRE菌株中肺炎克雷伯菌占的比例最高(92%)，且為多重耐藥菌株，甚至可能是泛耐藥菌株，主要原因是高產(chǎn)ESBL和碳青霉烯酶。有文獻(xiàn)報道，改良Hodge試驗對KPC-2和OXA有較好的靈敏度[11-12]，但對VIM、IMP和NDM不敏感；ESBL的耐藥表型確證試驗的靈敏度和特異度均較低，這可能是由于EICU中病原菌耐藥機制復(fù)雜、合并多種ESBL的產(chǎn)生。EDTA協(xié)同試驗是一種臨床上最為實用的MBL初篩方法[13]，然而該方法主要是針對B類MBL，對KPC、OXA-48等特異度較低[14-15]。

本研究碳青霉烯類耐藥基因以KPC-2型為主，陽性率占86%，屬于A類碳青霉烯酶，可水解碳青霉烯類抗生素；ESBL以TEM和SHV為主，陽性率分別為86%、96%，對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，這與國外文獻(xiàn)報道相符[16]。另外，由于本次研究對象主要為腸桿菌科細(xì)菌，而獲得性MBL又主要存在于銅綠假單胞菌和不動桿菌屬中[17]，所以MBL耐藥基因陽性率較低。本實驗中IMP陽性率為4%，VIM無陽性菌株，NDM-1陽性率為6%，包括2株大腸埃希菌和1株陰溝腸桿菌。Zhou等[18]報道在大腸埃希菌和陰溝腸桿菌中也分離出了NDM-1。而NDM-1是2008年首次分離于印度新德里的1株肺炎克雷伯菌中，曾被視為“超級細(xì)菌”，說明NDM-1在國內(nèi)已經(jīng)開始播散，應(yīng)引起我們高度重視。耐藥基因SME和OXA-48未擴增出陽性菌株，這可能是因為SME主要存在于由染色體介導(dǎo)的黏質(zhì)沙雷菌中，OXA-48水解底物譜狹窄，水解效能較低。

本研究中47株肺炎克雷伯菌經(jīng)同源性分析電泳條帶相同，1株肺炎克雷伯菌肺炎亞種與其相差2條條帶，為不同亞型，說明EICU存在克隆菌株流行趨勢。本院主要流行的基因型有KPC-2、SHV、TEM,其中KPC-2可引起醫(yī)院感染暴發(fā)，尤其是在ICU播散能力很強、致死率相當(dāng)高[19]。Woodford等[20]研究發(fā)現(xiàn)，KPC型碳青霉烯酶在菌屬之間克隆播散能力如此強大，主要因為KPC型碳青霉烯酶基因位于Tn4401的轉(zhuǎn)座子上，雖然不同地區(qū)該結(jié)構(gòu)不完全一樣，但其轉(zhuǎn)染細(xì)菌的能力沒有太多差異。大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的ERIC-PCR電泳條帶各不相同，為散發(fā)性的。NDM-1型耐藥基因的出現(xiàn)應(yīng)引起我們的高度重視，有必要深入研究其耐藥機制，并重視耐藥監(jiān)測。特別是呼吸道感染，可能由于患者長期臥床，痰液排出受阻，頻繁侵襲性操作使患者呼吸道防御功能受損且未嚴(yán)格無菌操作，而導(dǎo)致交叉感染。同時多數(shù)患者在入住EICU前均用過多種抗菌藥物，使患者體內(nèi)免疫力低下且菌群失調(diào)。有研究表明，對重度感染患者起始合理的治療會降低患者病死率[21]，所以我們應(yīng)根據(jù)不同病情制定相應(yīng)抗菌藥物使用策略，如循環(huán)治療、降階梯治療、短程治療等。最后，應(yīng)該提高大家對感染監(jiān)控的認(rèn)識和手衛(wèi)生的執(zhí)行率，加強對周圍環(huán)境衛(wèi)生的管理，從而阻斷耐藥菌的產(chǎn)生和傳播，預(yù)防和控制感染的發(fā)生。

[ 1 ] 簡子娟,劉文恩.腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶基因檢測及流行病學(xué)研究 [D].中南大學(xué)，2011.

[ 2 ] Queenan AM，Torres-Viera C，Gold HS, et al．SME-type carbapenem-hydrolyzing class A beta-lactamases from geographically diverseSerratiamarcescensstrains[J].Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(11)：3035-3039.

[ 3 ] Mariel MA, John J, Krishnappa LG, et al. Molecular characterization of theb‐lactamases inEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaefrom a tertiary care hospital in Riyadh, Saudi Arabia[J]. Microbiol Immunol, 2013, 57(12): 805-810.

[ 4 ] Tsakris A，Pournaras S，Woodford N, et al．Outbreak of infections caused byPseudomomasaeruginosaproducing VIM-1 carbapenemase in Greece[J].J Clin Microbiol,2000，38(3)：1290-1292．

[ 5 ] Moland ES, Hanson ND, Black JA, et al. Prevalence of newer-lactamases in gram-negative clinical isolates collected in the United States from 2001 to 2002[J]. J Clin Microbiol,2006,44(9), 3318-3324.

[ 6 ] Balkan II, Aygun G, Aydin S, et al. Blood stream infections due to OXA-48-like carbapenemase-producingEnterobacteriaceae: treatment and survival[J]. Int J Infect Dis,2014:51-56.

[ 7 ] Giakkoupi P,Pappa O,polemis M, et al.EmergingKlebsiellapneumoniaeisolates coproducing KPC-2 and VIM-1 carbapenemases[J]. Antimicrob Agents Chemother,2009,53(9):4048-4050.

[ 8 ] 甘龍杰,吳秀風(fēng),高麗欽,等.碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌基因型檢測及同源性分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2014,26(3):316-318.

[ 9 ] 王靖 ，楊愛芝，趙應(yīng)蘭.小兒重癥監(jiān)護(hù)病房多重耐藥菌的分析與控制[J] ． 長江大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2011， 8 (3): 202-203.

[10] 余劍文.重癥醫(yī)學(xué)科院內(nèi)感染病原體分布及耐藥分析[J].實用心腦肺血管病雜志,2013，21(9):99-100.

[11] Bartolini A, Frasson I, Cavallaro A, et al. Comparison of phenotypic methods for the detection of carbapenem non-susceptibleEnterobacteriaceae[J]. Gut Pathog,2014, 6:13.

[12] Baykal A, C?plü N, Simsek H, et al. The presence of extended spectrum beta-lactamase, KPC-type carbapenemase and plasmid-mediated AmpC beta-lactamase inE.coliandK.pneumoniaestrains isolated from blood cultures[J]. Mikrobiyol Bul, 2012,46(2):159-169

[13] Pournaras S, Zarkotou O, Poulou A, et al. A combined disk test for direct differentiation of carbapenemase-producing enterobacteriaceae in surveillance rectal swabs[J] . J Clin Microbiol, 2013, 51(9):2986-2990.

[14] Giske CG, Gezelius L, Samuelsen φ, et al. A sensitive and specific phenotypic assay for detection of metallo-β-lactamases and KPC inKlebsiellapneumoniaewith the use of meropenem disks supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin[J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17(4):552-556.

[15] Arunagiri K, Sekar B, Sangeetha G, et al. Detection and characterization of metallo-beta-lactamases inPseudomonasaeruginosaby phenotypic and molecular methods from clinical samples in a tertiary care hospital[J], West Indian Med J, 2012, 61(8):778-783.

[16] Mouloudi E, Protonotariou E, Zagorianou A, et al. Bloodstream infections caused by metallo-β-lactamase/Klebsiellapneumoniaecarbapenemase-producingK.pneumoniaeamong intensive care unit patients in Greece: risk factors for infection and impact of type of resistance on outcomes[J]. Infect Control Hosp Epidemiol, 2010,31(12):1250-1256.

[17] 張國雄,孟小斌,古漢福，等.ICU 耐碳青霉烯類鮑氏不動桿菌的分子流行病學(xué)及耐藥基因研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013,23 (11):2527-2529.

[18] Zhou G, Guo S, Luo Y, et al. NDM-1-producing Strains, FamilyEnterobacteriaceae, in Hospital, Beijing, China[J]. Emerg Infect Dis, 2014,20(2):340-342.

[19] Córdova E, Lespada MI, Gomez N, et al. Clinical and epidemiological study of an outbreak of KPC-producingKlebsiellapneumoniaeinfection in Buenos Aires, Argentina[J]. Enferm Infecc Microbiol Clin,2012, 30(7):376-379.

[20] Woodford N, Zhang J, Warner M, et al. Arrival ofKlebsiellapneumoniaeproducing KPC carbapenemase in the United Kingdom[J]. J Antimicrob Chemother, 2008,62(6):1261-1264.

[21] 王守君,翟萍,王世富，等.重癥加強治療病房的細(xì)菌耐藥監(jiān)測[J].中國實用醫(yī)藥，2010,25(5):8-10.

Molecular epidemiology of carbapenem-resistantEnterobacteriaceaein an emergency intensive care unit

LIU Shumin, XU Yunmin, NIU Min, CHEN Ruichun, DU Yan

. (The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Yunnan Institution of Laboratory Diagnostics, Kunming 650032, China)

Objective To characterize the molecular epidemiology of carbapenem-resistantEnterobacteriaceae(CRE) in an emergency intensive care unit (EICU) for rational antimicrobial therapy. Methods Specimens were collected between December 2011 and October 2014 from patients treated in the EICU to isolate and identify CRE strains by an automated analyzer (VITEK 2). Modified Hodge test (MHT), metallo-beta-lactamases (MBL) and extended spectrum β-lactamases (ESBLs) phenotype confirmation test, and polymerase chain reaction were carried out to characterize the strains. The homology of strains was analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR. Results A total of 52 strains of CRE were identified. Carbapememase and ESBLs were highly prevalent in the CRE isolated from this EICU. Overall, 96%, 13% and 52% of the strains were positive for MHT, MBL and ESBLs confirmation test, respectively. PCR analysis showed that majority of the enzymes were KPC-2, TEM, and SHV, a prevalence of 86%, 86% and 96%, respectively. NDM-1 gene was identified from two strains ofE.coliand one strain ofE.cloacae. ERIC-PCR demonstrated that 48 of the carbapenem-resistantK.pneumoniaeisolates belonged to the same genotype. Conclusions Carbapememase and ESBLs are highly prevalent in the CRE isolated from this EICU. Most of the CRE strains are from the same clone, suggesting the possibility of an epidemic. It is necessary to put aggressive infection control measures in place to control the spread of these bacteria.

emergency intensive care unit; carbapenem-resistantEnterobacteriaceae; homology

云南省聯(lián)合專項基金項目(2012FB040)。

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南省實驗診斷研究所，昆明 650032。

劉淑敏(1988—)，女，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥研究。

杜艷，E-mail：duyan_m@139.com。

R978.11

A

1009-7708(2015)04-0372-05

2014-12-17

2015-01-27