楊建剛,趙中開(kāi),吳赫川,周 健,潘訓(xùn)海,馬瑩瑩，*

(1.四川理工學(xué)院,四川自貢 643000;2.自貢市食品藥品監(jiān)督管理局,四川自貢 643000)

響應(yīng)面法優(yōu)化純種米根霉酒曲制備工藝的研究

楊建剛1,趙中開(kāi)2,吳赫川1,周 健1,潘訓(xùn)海1,馬瑩瑩1，*

(1.四川理工學(xué)院,四川自貢 643000;2.自貢市食品藥品監(jiān)督管理局,四川自貢 643000)

以南方秈米為原料,利用單因素實(shí)驗(yàn)和BBD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)以糖化酶活力為指標(biāo)對(duì)純種米根霉酒曲制備工藝進(jìn)行研究。主要對(duì)影響酒曲糖化酶活力的3個(gè)重要因素:培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量進(jìn)行研究。結(jié)果表明最佳工藝條件為:培養(yǎng)溫度33 ℃,接種量0.6 mL/瓶,培養(yǎng)時(shí)間115 h。在此條件下糖化酶活力的預(yù)測(cè)值為295.2 U/g。在最佳培養(yǎng)條件下對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)測(cè)糖化酶活力為290.5 U/g,與模型預(yù)測(cè)值基本一致,從而驗(yàn)證了模型的可靠性和實(shí)用性。

米根霉,響應(yīng)面法,酒曲,制備工藝,優(yōu)化

霉菌作為一種在各種酒曲中都存在的功能菌,是我國(guó)酒曲微生物的重要組成部分。霉菌具有糖化力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),并能產(chǎn)生多種影響酒類(lèi)風(fēng)味的物質(zhì),在酒的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。常用于釀酒的霉菌主要包括根霉屬(Rhizopus)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)、犁頭霉屬(Absidia)、青霉屬(Penicillium)等[1]。其中米根霉與米曲霉作為兩種糖化力很強(qiáng)的霉菌,廣泛存在于各種酒曲中。呂旭聰?shù)萚2]對(duì)紅曲中的絲狀真菌進(jìn)行了研究,在分離得到的43種真菌中發(fā)現(xiàn)了11種根霉,其種類(lèi)數(shù)量?jī)H次于曲霉,其中米根霉的出現(xiàn)頻率最高。于博等[3]對(duì)廣東肇慶傳統(tǒng)小曲的優(yōu)勢(shì)霉菌進(jìn)行了分離,得到糖化酶活力強(qiáng)的菌株F6,經(jīng)鑒定為米根霉。Hye-Ryun Kim等[4]在韓國(guó)的傳統(tǒng)酒曲中也發(fā)現(xiàn)了米根霉與米曲霉。

在眾多的創(chuàng)新工藝?yán)?以純種根霉代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝制曲就是其中很有代表性的一項(xiàng)。相比于傳統(tǒng)小曲,純種根霉曲具有糖化發(fā)酵力高、制作周期短、生產(chǎn)成本低等顯著優(yōu)勢(shì)。王新惠[5-6]在米根霉產(chǎn)糖化酶研究中得出反應(yīng)時(shí)間、不同底物、底物濃度、反應(yīng)溫度、底物pH及金屬離子等因素影響該菌株分泌的糖化酶酶活力。徐成勇[7]、龍可[8]在根霉曲、釀酒小曲研究進(jìn)展中闡述了米根霉在釀酒生產(chǎn)中的重要地位。本研究參考李云雁[9]、徐向宏[10]、劉寅[11]在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理方法,在純種米根霉種曲的制備及工藝條件優(yōu)化基礎(chǔ)上[12],旨在優(yōu)化出最佳的純種米根霉酒曲制作工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:米根霉CICC 40467購(gòu)于中國(guó)微生物菌種網(wǎng),保藏于葡萄糖馬鈴薯瓊脂(PDA)斜面中。

原輔料:南方秈米,市售,含水量12.5%;蒸餾水,符合GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。

恒溫培養(yǎng)箱(LHP-250) 常州普天儀器制造有限公司;生物顯微鏡(BH200) 寧波舜字儀器有限公司;高溫蒸汽滅菌鍋(SYQ-DSX-280B) 申安醫(yī)療器誡廠;電子天平(6102) 杭州友恒稱(chēng)重有限公司;電冰箱(BCD-256L) 青島樂(lè)家電器有限公司;超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒曲制作工藝流程 原料(秈米)→淘米→浸米12 h→瀝水→分裝三角瓶25 g→蒸米110 ℃,45 min→降溫→接種米根霉菌懸液→培養(yǎng)→扣瓶 1次/12 h→出曲

1.2.2 工藝操作要點(diǎn) 淘米:除去附在米粒表面的雜質(zhì),如糠、塵土及夾雜物等。

浸米:采用蒸餾水在20 ℃的條件下浸泡12 h以上。當(dāng)米粒從外觀上看透明感消失,變成純白色,用手碾米粒,能將米粒碾碎時(shí),即可將秈米撈出,瀝水30 min,分裝蒸米。

蒸米:每個(gè)250 mL三角瓶中分裝25 g生米,用高壓蒸汽滅菌鍋蒸米,條件為110 ℃,45 min。使蒸出的秈米熟而不爛,內(nèi)無(wú)白心生米;降溫:將蒸熟后的米置于接種箱內(nèi)降溫。

接種:當(dāng)米的品溫降至約35 ℃時(shí)接種米根霉菌懸液(取一支33 ℃條件下培養(yǎng)5 d的米根霉斜面,在超凈工作臺(tái)中以無(wú)菌操作的方式加入10 mL無(wú)菌水,然后用接種環(huán)將斜面上的孢子輕輕刮下制成孢子懸液)。

恒溫培養(yǎng):前24 h為31 ℃恒溫培養(yǎng),24 h之后調(diào)至所需溫度培養(yǎng);扣瓶:由于菌絲的生長(zhǎng)會(huì)造成米粒結(jié)塊,使米曲的質(zhì)量下降。因此應(yīng)及時(shí)扣瓶,將結(jié)塊的米粒打散。本實(shí)驗(yàn)的扣瓶頻率為1次/12 h。

1.2.3 粗酶液的制備 稱(chēng)取5 g絕干米曲樣品,置于研缽中充分研磨;然后向研缽中加入25 mL、pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液,繼續(xù)研磨至糊狀;用75 mL蒸餾水將其完全轉(zhuǎn)移至250 mL燒杯中,35 ℃水浴浸提1 h,期間每15 min攪拌1次;浸提完成后以脫脂棉過(guò)濾,濾液即為供試酶液[13]。

1.2.4 糖化酶活力的測(cè)定糖化酶活力的定義 1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)于40 ℃、pH4.6的條件下,1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖即為一個(gè)酶活力單位,以U/g(或U/mL)表示[13]。測(cè)定方法:采用GB8267-2006中規(guī)定的方法對(duì)曲的糖化酶活力進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 首先利用溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間三個(gè)單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析(單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值),找出各因素的水平范圍,然后通過(guò)BBD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳制曲工藝。

1.2.5.1 制曲時(shí)間對(duì)糖化酶活性的影響 分別采用2、3、4、5、6 d的制曲時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)結(jié)束后,取樣測(cè)糖化酶活力。單因素實(shí)驗(yàn)中溫度為35 ℃,接種量為0.5 mL/瓶,每12 h翻曲一次。

1.2.5.2 接種量對(duì)糖化酶活性的影響 分別采用0.1、0.3、0.5、1、1.5、2 mL/瓶的接種量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)結(jié)束后,取樣測(cè)糖化酶活力。該單因素實(shí)驗(yàn)中溫度為35 ℃,培養(yǎng)時(shí)間為4 d,每12 h翻曲一次。

1.2.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)糖化酶活性的影響 分別在29、31、33、35、37 ℃下進(jìn)行制曲實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)結(jié)束后,取樣測(cè)糖化酶活力。該單因素實(shí)驗(yàn)中接種量為0.5 mL/瓶,制曲時(shí)間為4 d,每12 h翻曲一次。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 為了研究不同因素對(duì)米根霉曲糖化酶活力的影響并確定最佳制曲條件,本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)曲糖化酶活力影響較大的3個(gè)因素(培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間)做響應(yīng)面回歸分析,實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)米根霉曲糖化酶活力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)米根霉曲糖化酶活力的影響Fig.1 Effect of culture time on glucoamylase activity of Rhizopus oryzae

由圖1可知,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在2～6 d時(shí),糖化酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間的增加先上升后下降,在4 d時(shí)糖化酶活力達(dá)到最大,隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),糖化酶活力開(kāi)始逐漸降低。在小曲中優(yōu)良根霉的分離篩選及產(chǎn)酶條件研究[15]中顯示,分離的根霉菌株培養(yǎng)3、4 d有利于其生長(zhǎng)和產(chǎn)酶,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。因此,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中選擇3、4、5 d三個(gè)培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.2 接種量對(duì)米根糖化酶活力的影響 結(jié)果如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)米根糖化酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculation quantity on glucoamylase activity of Rhizopus oryzae

由圖2可知,當(dāng)接種量在0.1～2 mL/瓶的范圍內(nèi)變化時(shí),糖化酶活力先快速上升而后逐漸下降。當(dāng)接種量為0.5 mL/瓶時(shí),糖化酶活力最高,隨著接種量的繼續(xù)增大,糖化酶活力開(kāi)始逐漸降低。分析原因,當(dāng)接種量較大,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都用來(lái)米根霉自身生長(zhǎng),較早進(jìn)入衰老期,不利于代謝產(chǎn)物的合成分泌,因此,合適的接種量有利于米根霉在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生更多高活性的糖化酶[16]。因此,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中選擇0.1、0.5、1 mL/瓶三個(gè)接種量。

2.1.3 溫度對(duì)米根霉曲糖化酶活力的影響 由圖3可知,隨著溫度的升高,糖化酶活力呈現(xiàn)出先升高后降低的變化規(guī)律,在33 ℃時(shí),糖化酶活力最高。當(dāng)溫度大于33 ℃時(shí),糖化酶活力開(kāi)始逐漸降低。究其原因,可能是因?yàn)樵跍囟容^低時(shí),米根霉的生長(zhǎng)不旺盛,產(chǎn)酶量較低,而溫度過(guò)高時(shí)同樣也會(huì)對(duì)米根霉的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制,使曲的糖化酶活力較低。在米根霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶工藝條件研究[17]中,米根霉在32 ℃條件下發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力最高,與本研究相符。因此在設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí),選用31、33、35 ℃三個(gè)培養(yǎng)溫度。

圖3 溫度對(duì)米根霉曲糖化酶活力的影響Fig.3 Effect of culture temperature on glucoamylase activity of Rhizopus oryzae

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

該響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)共包含15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),這15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)大體可分為兩類(lèi):一類(lèi)是析因點(diǎn),是自變量取值在正方體棱的中間處的實(shí)驗(yàn)點(diǎn),共有12個(gè);另一類(lèi)是零點(diǎn),是自變量取值在正方體中心的實(shí)驗(yàn)點(diǎn),零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次,用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析,最終得到的回歸方程為:Y=263.82-2.38A+25.74B+74.75C+19.56AB-27.52AC+5.80BC-127.46A2-96.83B2-49.56C2,R2=0.9605。然后,對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出,此模型的p<0.01,說(shuō)明該響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平。其決定系數(shù)R2=0.9605,表明模型中96.05%的數(shù)據(jù)可用這個(gè)模型解釋。本實(shí)驗(yàn)所建模型中C、A2、B2、C2對(duì)糖化酶活力的影響顯著(p<0.05),失擬項(xiàng)數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著,因此該二次模型能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面數(shù)據(jù)。

2.2.1 模型分析討論 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到響應(yīng)曲面(RSM)的三維圖,其綜合反映了各變量與響應(yīng)值之間、變量與變量之間的關(guān)系。

培養(yǎng)溫度和接種量的交互作用：由圖4可知,響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭,表明響應(yīng)值(糖化酶活力)對(duì)培養(yǎng)溫度和接種量的改變較為敏感。從等高線圖可以看出兩個(gè)因素的交互作用較弱,對(duì)糖化酶活力的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析

圖4 培養(yǎng)溫度和接種量的響應(yīng)面Fig.4 Response surface plot of the culture temperature and inoculation quantity

注:R2=0.9605;p<0.01為極顯著,用**表示;0.010.05為不顯著。

培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用：由圖5可知,響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭,表明響應(yīng)值(糖化酶活力)對(duì)培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的改變較為敏感。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間保持不變時(shí),隨著培養(yǎng)溫度的升高,糖化酶活力先快速升高再緩慢下降;當(dāng)培養(yǎng)溫度保持恒定時(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),糖化酶活力先快速增加而后趨于平穩(wěn)。從等高線圖可以看出兩個(gè)因素的交互作用較弱,對(duì)糖化酶活力的影響不顯著。

圖5 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plot of the culture temperature and culture time

接種量和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用：由圖6可知,響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭,表明響應(yīng)值(糖化酶活力)對(duì)接種量和培養(yǎng)時(shí)間的改變較為敏感。從等高線圖可以看出兩個(gè)因素的交互作用較弱,對(duì)糖化酶活力的影響不顯著。

圖6 接種量和培養(yǎng)時(shí)間的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plot of the inoculation quantity and culture time

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及模型擬合的基礎(chǔ)上,利用“Design-Expert”軟件中的Optimization功能對(duì)制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到其最佳工藝養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度32.84 ℃,接種量0.56 mL/瓶,培養(yǎng)時(shí)間4.79 d。在此條件下糖化酶活力的預(yù)測(cè)值為295.20 U/g。在最佳培養(yǎng)條件下(33 ℃、0.6 mL/瓶、115 h,實(shí)際實(shí)驗(yàn)參數(shù))對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)際測(cè)得的糖化酶活力為(290.46±4.4)U/g,與計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)值基本一致,表明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間擬合較好,驗(yàn)證了模型的可靠性。

王新惠等[6]曾利用黃豆粉麩皮液體培養(yǎng)基對(duì)米根霉產(chǎn)糖化酶的發(fā)酵條件作了研究,其糖化酶活力最高達(dá)到135 U/g,遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)最佳工藝下的糖化酶活力。對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程分析后發(fā)現(xiàn),二者所采用的培養(yǎng)基存在較大的區(qū)別。在劉達(dá)玉等的實(shí)驗(yàn)中以黃豆粉和麩皮為培養(yǎng)料,并制成液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩發(fā)酵培養(yǎng);而在本實(shí)驗(yàn)中則是用秈米固體培養(yǎng)基以恒溫靜置的方式培養(yǎng)。因此推斷,與王新惠等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較,本研究在培養(yǎng)基上的巨大差異應(yīng)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果區(qū)別較大的主要原因。

3 結(jié)論

通過(guò)BBD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)影響米根霉(CICC 40467)曲糖化酶活力的3個(gè)主要因素(培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量)及制曲的最佳工藝條件進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示回歸模型是顯著的。利用“Design-Expert”軟件中的Optimization功能對(duì)制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到其最佳工藝條件為:培養(yǎng)溫度33 ℃,接種量0.6 mL/瓶,培養(yǎng)時(shí)間115 h。在此條件下糖化酶活力的預(yù)測(cè)值為295.2 U/g。在本實(shí)驗(yàn)最佳培養(yǎng)條件下對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)際測(cè)得的糖化酶活力為290.5 U/g,與模型預(yù)測(cè)值基本一致,從而驗(yàn)證了模型的可靠性。

隨著白酒行業(yè)的發(fā)展,純種根霉酒曲替代傳統(tǒng)小曲應(yīng)用于小曲酒的生產(chǎn)勢(shì)不可擋,在這種情況下,必然會(huì)有越來(lái)越多的小曲酒企業(yè)應(yīng)用這種工藝。在這種背景下,本實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的效果,同時(shí)為接下來(lái)的純種根霉酒曲釀酒實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the optimum technique of koji-making in pureRhizopusoryzaewith response surface methodology

YANG Jian-gang1,ZHAO Zhong-kai2,WU He-chuan1,ZHOU Jian1,PAN Xun-hai1,MA Ying-ying1,*

(1.Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China;2.Zigong Food and Drug Administration,Zigong,643000,China)

South indica rice was used for raw material and single factor experiment and BBD response surface methodology were applied to optimize the preparation technology of pureRhizopusoryzaekoji with saccharifying enzyme activity as an index. Three important factors(culture temperature,culture time,inoculating quantity)that had effects on Koji saccharifying enzyme activity and the optimum preparation technology condition were studied. Result showed that the process conditions as follows:culture temperature was at 33 ℃,the inoculating quantity was 0.6 mL/flask,and culture time was 115 h. In this condition,the predictive value of saccharifying enzyme activity was 295.2 U/g. And this prediction was verified under the optimum culture conditions. It showed that the actual measured saccharifying enzyme activity was 290.5 U/g. The predicted and measured were basically in accordance,which was verified the model was reliable and practical.

Rhizopusoryzae;response surface methodology;koji;processing;optimum

2015-01-28

楊建剛(1961-)，男，博士，研究方向：食品發(fā)酵與釀造技術(shù),E-mail：jgyang29@163.com。

*通訊作者:馬瑩瑩(1963-)，女，碩士，研究方向：食品發(fā)酵與釀造技術(shù)，E-mail：xidaya@163.com。

四川省(科技廳)科技創(chuàng)新苗子工程(2015022)；四川理工學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(2015RC14)；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510622055)；四川理工學(xué)院培育項(xiàng)目基金(2014PY05)。

TS261

B

1002-0306(2015)21-0232-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.040