王金墻，劉子泉，丁 輝，樊毫軍，董文龍，宋美娟，侯世科

·論著|ORIGINAL ARTICLES·

不同缺血后處理方案對(duì)家兔擠壓綜合征損傷保護(hù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

王金墻1，劉子泉2，丁 輝2，樊毫軍2，董文龍2，宋美娟2，侯世科2

目的 篩選不同缺血后處理(ischemic postconditioning，IPost)方案對(duì)家兔擠壓綜合征(crush syndrome，CS)損傷保護(hù)效應(yīng)的最佳時(shí)間窗。方法 選取48只家兔隨機(jī)分為對(duì)照組(S組)及5個(gè)不同IPost方案組(IPA～I(xiàn)PE組)，每組8只。建立CS模型，并于解壓前游離雙下肢股動(dòng)、靜脈，解壓后IPA組給予阻斷下肢血流5 s，再灌注5 s，共5個(gè)循環(huán)(即5×5 s/5 s)，IPB組5×30 s/30 s，IPC組5×1 min/1 min，IPD組5×5 min/5 min，IPE組3×10 min/10 min，繼續(xù)觀察至解壓后24 h。分別于建模前，解壓即刻及解壓后2、6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)家兔血液中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌紅蛋白(myoglobin，Mb)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的含量。結(jié)果 與S組相比，各IPost組均可降低解壓后CS家兔血清CK、Mb和NGAL的含量。在解壓后6、12、18、24 h，IPC、IPD組各指標(biāo)與S組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；IPC組各指標(biāo)較 IPD組低，但解壓后各時(shí)間點(diǎn)兩組之間比較無顯著差異。結(jié)論 CS家兔再灌注前給予1～5 min的肢體遠(yuǎn)隔IPost對(duì)損傷具有保護(hù)作用，其中給予5個(gè)循環(huán)的1 min缺血，1 min再灌后處理具有最佳保護(hù)效應(yīng)。

擠壓綜合征；缺血后處理；肌酸激酶；肌紅蛋白；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白

CS指四肢或軀干肌肉豐富的部位，遭受重物長時(shí)間擠壓，在解除壓迫后出現(xiàn)的以肢體腫脹、肌紅蛋白尿、高血鉀為特點(diǎn)的急性腎功能損傷，是地震傷亡中僅次于直接創(chuàng)傷以外的第二致死原因[1, 2]。盡管災(zāi)后發(fā)生率僅為8%左右，但因其所導(dǎo)致的死亡卻占總病死率的40%～60%[3]。近年來，我國地震災(zāi)害頻發(fā)，CS的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)[4]，對(duì)社會(huì)的安定和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了重大影響。關(guān)于CS的救治，除快速大量補(bǔ)液、堿化尿液、滲透性利尿和防治高血鉀等措施外，應(yīng)盡早行血液凈化治療[5]，然而多次救援實(shí)踐表明，CS患者最早接受血液凈化治療的時(shí)間多為震后8 h[4]。因此從解除壓迫至血液凈化治療的這段時(shí)間，能否通過其他有效治療手段來減輕或延遲CS所導(dǎo)致的機(jī)體損傷？有研究表明IPost在心臟、腎臟、大腦等缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。目前鮮有關(guān)于應(yīng)用IPost治療CS患者的報(bào)道，本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選不同IPost方案對(duì)家兔CS損傷保護(hù)作用的最佳時(shí)間窗。

1 材料與方法

1.1 材料 48只健康成年日本大耳白兔，6～12月齡，體重(2.3±0.2)kg，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0002]。于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，單只分籠喂養(yǎng)，保持室溫22～26 ℃，濕度60%～65%，自由攝食和飲水，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，正常供水。

1.2 模型建立 參考文獻(xiàn)[6, 7]的造模方法，并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)情況建立家兔CS模型。1%的戊巴比妥鈉3 ml/kg耳緣靜脈麻醉后，使用自動(dòng)氣壓止血帶(威海市博華醫(yī)療設(shè)備有限公司)給予家兔單下肢100 kPa擠壓8 h，解壓前游離雙下肢腹股溝處股動(dòng)、靜脈。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及方法 48只家兔隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為對(duì)照組( S組)，擠壓建模8 h后，不做任何處理。后處理A組(IPA組)，解壓后立即使用動(dòng)脈夾夾閉動(dòng)、靜脈5 s，再灌注5 s，循環(huán)5次，標(biāo)記為5×5 s/5 s。同樣，后處理B組(IPB組)，標(biāo)記為5×30 s/30 s。后處理C組(IPC組)，標(biāo)記為5×1 min/1 min。后處理D組(IPD組)，標(biāo)記為5×5 min/5 min。后處理E組(IPE組)，標(biāo)記為3×10 min/10 min。所有分組在解壓1 h后縫合雙下肢切口，繼續(xù)觀察24 h。

1.4 標(biāo)本處理和檢測(cè) 分別在建模前，解壓即刻及解壓后2、6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，通過耳中動(dòng)脈留置針抽取2 ml血液，4℃保存1 h后，離心(3000 r/min，15 min)取其上清液，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)CK的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)Mb、NGAL的含量，具體操作按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 各組家兔在擠壓建模的過程中均未出現(xiàn)死亡，解壓后均表現(xiàn)為精神萎靡，呼吸急促，四肢冰冷，受壓肢體均不能正?；顒?dòng)，腫脹明顯，遠(yuǎn)端肢體呈淤血表現(xiàn)。解壓2 h后各組均出現(xiàn)尿量減少，顏色加深，甚至出現(xiàn)棕紅色尿，解壓18 h后均為無尿狀況。

2.2 血清CK含量變化 解壓時(shí)各組血清CK的含量可升高至擠壓前的近10倍，并繼續(xù)升高。不同方案組內(nèi)解壓后各時(shí)間點(diǎn)與建模前及解壓即刻相比分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)。各時(shí)間點(diǎn)不同分組間兩兩比較顯示：在建模前及解壓即刻兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.005)；在解壓后2、6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPC組與S組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；在解壓后6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPB、IPD組與S組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；其余各時(shí)間點(diǎn)各組與S組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在解壓后12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPC組與IPA組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；在解壓后18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPD組與IPA組相比，IPC組與IPB組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；在解壓后6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPE組與IPB、IPC、IPD組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；其余各時(shí)間點(diǎn)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3 血清Mb含量變化 不同方案組解壓后各時(shí)間點(diǎn)血清Mb含量與建模前及解壓即刻相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)。各時(shí)間點(diǎn)不同分組間兩兩比較結(jié)果示：在建模前及解壓即刻兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組之間相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.005)；在解壓后2、6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPB、IPC、IPD組與S組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)，IPA、IPE組與S組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在解壓后2、6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPC、IPD組與IPA組相比，IPE組與IPC、IPD組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；在解壓后6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPC、IPD組與IPB組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；其余各時(shí)間點(diǎn)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.4 血清NGAL含量變化 不同方案組解壓后各時(shí)間點(diǎn)血清NGAL含量與建模前及解壓即刻相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)。各時(shí)間點(diǎn)不同分組間兩兩比較結(jié)果顯示：在建模前及解壓即刻兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組之間相比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在解壓后12、18 h時(shí)間點(diǎn)，IPA、IPB、IPE組與S組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；在解壓后2、6、12、18、24 h時(shí)間點(diǎn)，IPC、IPD組與S組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；在解壓后2、6、12、18 h時(shí)間點(diǎn)，IPC、IPD組與IPA組相比，IPC組與IPB組相比，IPE組與IPC、IPD組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；其余各時(shí)間點(diǎn)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表1 各組家兔血清CK含量隨時(shí)間變化情況 (n=8；×103 U/L；

注： S組為對(duì)照組，IPA組為后處理5×5 s/5 s組，IPB組為5×30 s/30 s組，IPC組為5×1 min/1 min組，IPD組為5×5 min/5 min組，IPE組為3×10 min/10 min組；與S組比較，①P<0.005；與IPA組比較，②P<0.005；與IPB組相比，③P<0.005；與IPC組相比④P<0.005；與IPD組相比，⑤P<0.005

表2 各組家兔血清Mb含量隨時(shí)間變化情況 (n=8；ng/ml；

注：S組為對(duì)照組，IPA組為后處理5×5 s/5 s組，IPB組為5×30 s/30 s組，IPC組為5×1 min/ 1min組，IPD組為5×5 min/5 min組，IPE組為3×10 min/10 min組；與S組比較，①P<0.005；與IPA組比較，②P<0.005；與IPB組相比，③P<0.005；與IPC組相比，④P<0.005；與IPD組相比，⑤P<0.005

表3 各組家兔血清NGAL含量隨時(shí)間變化情況 (n=8；pg/ml；

注：S組為對(duì)照組，IPA為后處理5×5 s/5 s組，IPB為5×30 s/30 s組，IPC為5×1 min/1 min組，IPD為5×5 min/5 min組，IPE為3×10 min/10 min組；與S組比較，①P<0.005；與IPA組比較，②P<0.005；與IPB組相比，③P<0.005；與IPC組相比，④P<0.005；與IPD組相比，⑤P<0.005

3 討 論

地震災(zāi)害中擠壓傷多發(fā)生于四肢，因下肢肌肉組織豐富，故本研究以家兔下肢作為擠壓位置。在擠壓壓力的選擇上，根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及災(zāi)害現(xiàn)場救援情況分析，通常導(dǎo)致患者擠壓傷的重物重量多為患者體重的5～10倍，根據(jù)止血帶的有效寬度3 cm計(jì)算，故選擇100 kPa作為恒定擠壓壓力。文獻(xiàn)[8]報(bào)道，肌肉組織受擠壓2～4 h即可發(fā)生損傷，超過6 h可發(fā)生不可逆性損傷，隨著擠壓的時(shí)間延長，發(fā)生CS的可能性逐漸增高。同時(shí)多次救援實(shí)踐案例調(diào)查發(fā)現(xiàn)，專業(yè)救援人員多在震后5～8 h到達(dá)災(zāi)害現(xiàn)場，部分研究實(shí)驗(yàn)選擇震后8 h作為擠壓綜合征的造模時(shí)間[2]，綜合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究使用自動(dòng)氣壓止血帶給予家兔單下肢100 kPa壓力8 h以建立家兔CS模型，解壓后家兔下肢出現(xiàn)瘀斑，腫脹嚴(yán)重，尿量逐漸減少，甚至出現(xiàn)肌紅蛋白尿及無尿。解剖發(fā)現(xiàn)，下肢擠壓處肌肉顏色加深，組織間液明顯增多。解壓后各血液檢測(cè)指標(biāo)顯著升高，說明家兔已發(fā)生橫紋肌溶解并導(dǎo)致急性腎衰竭，證明CS建模成功。

IPost是指在組織、器官缺血恢復(fù)血供之前，給予短暫、數(shù)次的再灌注-缺血的處理過程，以有效改善組織器官發(fā)生缺血再灌注損傷。由 Zhao等[9]在2003年利用犬心肌梗死模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，并首次提出了其概念。盡管IPost在心臟、腎臟、大腦等缺血損傷具有一定的保護(hù)作用，但不同的時(shí)間方案及循環(huán)次數(shù)產(chǎn)生的治療效果也有所不同。李嵩山等[10]在孕兔失血性休克的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，給予雙下肢股動(dòng)脈缺血30 s/再灌注30 s，循環(huán)10次后，可以有效的減輕缺血再灌注對(duì)腎功能的損傷。Jiang等[11]在切除右腎建立的急性腎衰模型中發(fā)現(xiàn)分別給予6個(gè)循環(huán)的10 s、30 s、1 min的IPost均對(duì)腎移植具有炎性反應(yīng)的保護(hù)作用，并且10 s組的缺血后處理效果最佳。Kerendi等[12]利用小鼠的心梗模型，對(duì)腎動(dòng)脈實(shí)施單次5 min的遠(yuǎn)隔缺血后處理，可以顯著減輕心肌缺血再灌注所導(dǎo)致的損傷。因此研究設(shè)計(jì)了5 s～10 min的IPost時(shí)間窗，進(jìn)行不同的IPost方案對(duì)家兔CS損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究。

由于CK、Mb主要存在于骨骼肌和心肌等細(xì)胞中，當(dāng)骨骼肌損傷時(shí)，其表達(dá)水平可迅速上升；NGAL是急性腎損傷的生物標(biāo)志物之一，其表達(dá)的增加對(duì)CS的早期診斷和病情評(píng)估具有重要意義。因此，本研究主要以血液中CK、Mb和NGAL的含量作為最佳IPost時(shí)間窗的篩選指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，建模前及解壓即刻，各處理組各指標(biāo)兩兩比較示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在解壓后6、12、18、24 h，IPC、IPD組血清CK、Mb和NGAL含量與S組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中血清CK含量IPC、IPD組在解壓后18、24 h與IPA組，解壓后6、12、18、24 h與IPE組相比差異均顯著；血清Mb含量IPC、IPD組在解壓后2、6、12、18、24 h與IPA、IPE組，解壓后6、12、18、24 h與IPB組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清NGAL含量IPC、IPD組在解壓后2、6、12、18 h與IPA、IPE組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。解壓后各時(shí)間點(diǎn)IPC組各指標(biāo)較 IPD組低，但兩組之間比較均無顯著差異。說明通過有創(chuàng)IPost可有效降低CS所致機(jī)體損傷，其中給予5個(gè)循環(huán)1 min缺血、1 min再灌注為效果最佳IPost方案。

綜上所述，本研究利用自動(dòng)氣壓止血帶，建立了穩(wěn)定的家兔CS模型，通過設(shè)置多組不同時(shí)間方案，篩選并得出結(jié)論：CS家兔再灌注前給予1～5 min的肢體遠(yuǎn)隔IPost對(duì)損傷具有保護(hù)作用，其中給予5個(gè)循環(huán)的1 min缺血，1 min再灌后處理具有最佳保護(hù)效應(yīng)。IPost操作簡單可行，應(yīng)用前景廣泛，具有重要臨床價(jià)值。但是，關(guān)于IPost應(yīng)用于CS的案例鮮有報(bào)道，且本研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因物種的差異，得出的結(jié)論在人類的臨床治療中是否同樣顯著，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(2015-03-31收稿 2015-04-22修回)

(責(zé)任編輯 付 輝)

Experimental study on the protective effect of different ischemic postconditioning scheme in rabbits with crush syndrome

WANGJinqiang1，LIUZiquan2，DINGHui2，F(xiàn)ANHaojun2，DONGWenlong2，SONGMeijuan2，andHOUShike2.

1.SpecialtyofEmergencyMedicine,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003,China; 2.InstituteofDisasterandEmergencyRescueMedicine,AffiliatedHospitalofLogisticsCollege,ChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,ChinaCorrespondingauthor:HOUShike,E-mail:houshike@126.com

Objective To screen the best time-window of the protective effect of different ischemia postconditioning (IPost) scheme on rabbits with crush syndrome (CS) injury. Methods 48 healthy Japanese white rabbits were selected and randomly divided into control group (S group) and 5 groups of different IPost scheme (IPA～I(xiàn)PE group), 8 rabbits each. CS model was established, and femoral arteries and veins were separated in the groin of both lower limbs before releasing of pressure. After decompression, the arteries of IPA group were treated with bulldog climp clamping for 5 s, then releasing 5 s, and repeated for 5 cycles (5×5 s/5 s), IPB group was 5×30 s/30 s, IPC group was 5×1 min/1 min, IPD group was 5×5 min/5 min, IPE group was 3×10 min/10 min, observation lasted 24 h after releasing of pressure. The concentration of serum creatine kinase (CK), myoglobin (Mb) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) were detected before establishment of CS model, immediateness after decompression and 2, 6, 12, 18 and 24 h after decompression. Results Compared with S group, the concentration of serum CK, Mb and NGAL were reduced in all Ipost groups after decompression. All indexes of groups of IPC and IPD in 6, 12, 18, 24 h after decompression was statistical significant in comparison with S group (P<0.005); All indexes of IPC group were lower than IPD group in each time point after decompression, but there was no significant difference. Conclusions Giving 1-5 min remote ischemia postconditioning for 5 cycles before reperfusion to rabbits with crush syndrome may produce effective protection to organism injuries; among these groups, IPC group (5×1 min/1 min) showed the most obvious effect.

crush syndrome; ischemic postconditioning; creatine kinase；myoglobin; neutrophil gelatinase-associated lipocalin

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.05.003

國家自然科學(xué)基金課題(71173232)；天津市重點(diǎn)支撐項(xiàng)目(12ZCZDSF00700)

王金墻，碩士研究生在讀，E-mail: cnwangjq@126.com

1. 453003，河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院急救醫(yī)學(xué)專業(yè)； 2. 300162 天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院救援醫(yī)學(xué)研究所

侯世科，E-mail: houshike@126.com

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