肌醇對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用

趙倩倩，宋揚(yáng)，劉桂園，陳沉

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)研究所，山東 青島 266021)

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·腫瘤專題·

肌醇對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用

趙倩倩，宋揚(yáng)，劉桂園，陳沉

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)研究所，山東 青島 266021)

目的 觀察肌醇對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響，探討肌醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡方面的作用。方法 采用MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度肌醇對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制率；免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化及凋亡發(fā)生率。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著肌醇劑量的增加，肌醇對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制率明顯增高(F=682.048，q=8.293～44.146，P<0.05)；免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，肌醇干預(yù)組對(duì)PCNA的表達(dá)有顯著抑制的作用(F=149.973，q=4.450～20.826，P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著肌醇劑量的增加，HT-29細(xì)胞停留在G0/G1期比例增加，S期、G2/M期的比例減少(F=31.109～59.178,q=2.660～12.783，P<0.05)；與對(duì)照組相比，各肌醇干預(yù)組HT-29細(xì)胞凋亡率均有明顯升高(F=1 214.826，q=16.587～56.885，P<0.05),并且隨著肌醇劑量的增大，各肌醇干預(yù)組細(xì)胞凋亡率逐漸升高。結(jié)論 肌醇通過阻滯HT-29細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

肌醇；結(jié)腸腫瘤；HT-29細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

結(jié)腸癌是一種常見惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人們的健康，在世界范圍內(nèi)年發(fā)病率較高，僅次于肺癌及胃癌[1]。近年來，人們的生活質(zhì)量越來越高，飲食習(xí)慣也發(fā)生了很大的變化，結(jié)腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)。肌醇六磷酸(IP6)是一種含6個(gè)磷酸的肌醇酯，能抑制多種癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，具有廣譜抗癌活性[2-6]。IP6進(jìn)入體內(nèi)會(huì)迅速水解，在腸道中可解離形成其次級(jí)磷酸化形式。IP6可能是通過其次級(jí)磷酸化形式，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程而發(fā)揮抗癌功能。肌醇是IP6的次級(jí)磷酸化形式之一，它廣泛存在于谷類、豆類和干果中[7]。近年來研究顯示，肌醇能抑制肺癌、乳癌細(xì)胞的生長(zhǎng)分化[8-9]，但關(guān)于肌醇直接干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞的研究較少。本實(shí)驗(yàn)探討肌醇對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑 肌醇、四甲基偶氮噻唑鹽(MTT)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HT-29細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的抑制率 選用生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞，采用胰蛋白酶消化得到單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L。吹打均勻后，將其接種在96孔板(每孔100 μL)中,每組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔。12 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁較好，吸除各孔細(xì)胞液，各組分別加入100 μL含0 mmol/L肌醇(對(duì)照)及1、2、4 mmol/L肌醇的培養(yǎng)液。48 h后，每孔加20 μL的MTT溶液(5 g/L)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，除去各孔培養(yǎng)液，分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),連續(xù)震蕩5 min，待結(jié)晶物完全溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A)值(490 nm波長(zhǎng)處)，選取復(fù)孔A值的平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。腫瘤細(xì)胞抑制率(%)=(1-A干預(yù)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCNA的表達(dá)①使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，可得密度為5×108/L的細(xì)胞懸液。把載玻片(已高壓滅菌)置于培養(yǎng)皿中，載玻片中心滴加已調(diào)好密度的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)皿中滴加一定量的培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清)。每一組設(shè)3個(gè)平行樣，將其置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②12 h后吸去載玻片上液體，加入含0 mmol/L肌醇(對(duì)照)及1、2、4 mmol/L肌醇的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。③用鑷子取出載玻片，PBS清洗3次后，用冰浴的丙酮固定細(xì)胞5 min。④向載玻片中心加入Trition-X100溶液(體積分?jǐn)?shù)0.01)，10 min后用PBS清洗3次。⑤繼續(xù)向載玻片中心加體積分?jǐn)?shù)為0.30的H2O2，15 min后用PBS清洗3次。⑥對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。其中包括DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水，中性樹膠封片4個(gè)步驟。在光鏡下觀察，視野中細(xì)胞里出現(xiàn)棕黃(褐)色顆粒者視為陽(yáng)性。任取8個(gè)以上高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)120個(gè)細(xì)胞，同等條件下用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)平均值。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布的改變①選取狀態(tài)較好的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后得到細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，接種于6孔板，每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于 37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。②除去培養(yǎng)液，各組加入含0 mmol/L肌醇(對(duì)照組)及1、2、4 mmol/L肌醇培養(yǎng)液后，培養(yǎng)48 h。③用胰蛋白酶消化細(xì)胞，得到的細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，PBS清洗3次后，用冰浴乙醇(體積分?jǐn)?shù)為0.70)固定細(xì)胞4 h。④再用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min。⑤加入PI染液10 μL，慢慢吹打混勻細(xì)胞懸液，在37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育30 min(此過程需避光)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡①取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，以每孔1×105接種于6孔板中,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②吸去每孔培養(yǎng)液，分別加入含0 mmol/L肌醇(對(duì)照)及1、2、4 mmol/L的肌醇培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。③用胰蛋白酶消化各孔細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到105以上。PBS沖洗2次后，用Binding Buffer(400 μL)懸浮,加入AnnexinV-FITC(5 μL)混勻，在室溫下避光孵育15 min。④加入PI染色液(5 μL)混勻,冰浴避光靜置5 min，30 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)?；靹蚝笥昧魇郊?xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度肌醇干預(yù)對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組及1、2、4 mmol/L肌醇干預(yù)組48 h HT-29細(xì)胞的A值分別為1.503±0.017、1.309±0.016、1.207±0.018、0.959±0.018，各組間HT-29細(xì)胞A值比較，差異均有顯著性(F=682.048,q=8.293～44.146，P<0.05)。1、2、4 mmol/L肌醇干預(yù)組對(duì)細(xì)胞抑制率分別為12.9%、19.7%、46.2%。

2.2肌醇干預(yù)對(duì)HT-29細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

對(duì)照組及1、2、4 mmol/L肌醇干預(yù)48 h HT-29細(xì)胞PCNA的表達(dá)水平分別為0.496±0.014、0.396±0.004、0.348±0.018、0.2700±0.020。各肌醇干預(yù)組與對(duì)照組相比較，差異均有顯著意義(F=149.973，q=4.450～20.826，P<0.05)。

2.3肌醇干預(yù)對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，隨著肌醇干預(yù)濃度的升高，HT-29細(xì)胞周期分布產(chǎn)生了改變，阻滯于G0/G1期的細(xì)胞比例上升，S期和G2/M期的細(xì)胞比例下降。各肌醇干預(yù)組與對(duì)照組相比，差異均有顯著性(F=31.109～59.178,q=2.660～12.783，P<0.05)。見表1。

2.4肌醇干預(yù)對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組及1、2、4 mmol/L的肌醇干預(yù)48 h HT-29細(xì)胞的凋亡率分別為(2.585±0.065)%、(8.523±0.565)%、(15.665±0.287)%、(22.950±0.787)%。組間比較差異均有顯著性(F=1 214.826，q=16.587～56.885，P<0.05)。見圖1。

表1 不同濃度肌醇干預(yù)對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響

A：對(duì)照組，B：1 mmol/L肌醇干預(yù)組，C：2 mmol/L肌醇干預(yù)組，D：4 mmol/L肌醇干預(yù)組。

3 討 論

癌癥發(fā)生的本質(zhì)為細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡受阻[10]，因此，抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡在抗癌研究中尤為重要。本實(shí)驗(yàn)以結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為研究對(duì)象，從增殖和凋亡方面研究肌醇對(duì)癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響。

MTT法是常用的體外藥敏試驗(yàn)方法，通過該法可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性，從而反映癌細(xì)胞增殖狀態(tài)[11]。本研究通過觀察不同濃度肌醇干預(yù)對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，各干預(yù)組與對(duì)照組相比A值均降低，說明肌醇對(duì)HT-29細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。其中肌醇在4.0 mmol/L濃度時(shí)，抑制率可達(dá)46.2%，顯示出較優(yōu)的抗癌特性。

PCNA是DNA聚合酶δ的輔酶，能夠直接參與細(xì)胞的增殖(如DNA復(fù)制)。PCNA在未分裂的細(xì)胞中含量非常少，一般從DNA合成時(shí)的G1末期上升，至S期可達(dá)到峰值，G2期逐步下降，至M期含量降到最少，此變化正和細(xì)胞增殖相一致[12-13]。本研究通過免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定肌醇干預(yù)前后HT-29細(xì)胞PCNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，各肌醇干預(yù)組和對(duì)照組比較，平均PCNA的表達(dá)均明顯下降，表明肌醇能夠抑制細(xì)胞內(nèi)PCNA的表達(dá)，從而對(duì)癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。

癌細(xì)胞的增殖異常，關(guān)鍵點(diǎn)在于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控。在細(xì)胞周期中，G1→S→G2→M期相互轉(zhuǎn)換過程中有多個(gè)關(guān)卡調(diào)節(jié)著細(xì)胞周期的演進(jìn)速度，G1期能否成功進(jìn)入S期決定了細(xì)胞是否繼續(xù)增殖、停滯或死亡[14-15]。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度肌醇對(duì)HT-29細(xì)胞周期的分布的影響，可知肌醇能夠?qū)⒔Y(jié)腸癌HT-29細(xì)胞阻滯于G1期，且隨著肌醇劑量的增加，對(duì)細(xì)胞的周期阻礙作用更加顯著。從而可以認(rèn)為肌醇能夠阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而阻礙DNA合成而發(fā)揮抗增殖作用。

凋亡能夠清理已損的細(xì)胞，維持機(jī)體本身的平衡穩(wěn)態(tài)。癌癥發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一就是阻礙了細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肌醇能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著肌醇劑量的增加，HT-29細(xì)胞凋亡率逐步增加。

綜上所述，本研究從細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡方面證實(shí)了一定濃度的肌醇可通過阻滯HT-29細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抑制HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。其深層次的作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步探討。

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(本文編輯 厲建強(qiáng))

INHIBITION OF INOSITOL ON IN VITRO GROWTH OF COLON CANCER CELLS HT-29

ZHAOQianqian,SONGYang,LIUGuiyuan,CHENChen

(Department of Nutrition, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the effects of inositol on in-vitro growth of human colon cancer cell lines HT-29 and explore its action on the proliferation and apoptosis of the cells.MethodsEmploying MTT test to detect the inhibition rates of different concentrations of inositol on HT-29 cells. Applying immunocytochemistry to determine the expression of PCNA. Using flow cytometry to measure the cell circle changes and incidence of apoptosis.ResultsMTT result showed that the inhibition rate of inositol on HT-29 cells increased along with the increase of the dose of inositol (F=682.048,q=8.293-44.146,P<0.05). Immunocytochemical experiment indicated, compared with the control group, inositol-treated groups had a higher inhibition on expression of PCNA (F=149.973,q=4.450-20.826,P<0.05). Flow cytometry result demonstrated that along with the increase of the dose of inositol, the proportion of HT-29 cells stayed in G0/G1phase increased and the cells of phase S and phase G2/M decreased (F=31.109-59.178,q=2.660-12.783,P<0.05). Compared with the control group, the apoptosis rates of HT-29 cells in all inositol-treated groups increased (F=1 214.826,q=16.587-56.885,P<0.05), and along with the increase of the dose of inositol, apoptosis rates of HT-29 cells in inositol-treated groups were gradually elevated.ConclusionInositol plays a role to inhibit the growth of HT-29 cells of colon cancer through blocking HT-29 cell cycle, inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis of HT-29 cells.

inositol; colonic neoplasms; HT-29 cells; cell proliferation; apoptosis

2014-10-18;

2015-01-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373001)

趙倩倩(1988-)，女，碩士研究生。

宋揚(yáng)(1968-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。

R151.3

A

1008-0341(2015)03-0253-04