泉州市公安局 焦 志

1 材料和方法

1.1 樣本

棉簽血斑、泥土上的血斑、綠色葉子上血斑、深色布料上血斑、低模板DNA降解檢材樣本均來自日常案件檢材。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

（1）主要試劑：Identifiler、Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒。

（2）主要儀器：PE9700型DNA擴(kuò)增儀，ABI3130XL遺傳分析。

1.3 DNA的提取

分別剪取適量棉簽上血斑、綠色葉子上血斑、泥土上的血斑、深色布料上血斑放入0.5ml離心管中，加入300μL 5%Chelex-100，56℃孵育 1h，99℃變性 8min，13000rpm 離心3min，取 0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL 上述檢材樣本分別用Identifiler、Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒做梯度擴(kuò)增，電泳結(jié)果做比較。4份低模板量DNA樣本采用M48核酸純化法提取，各取1μL模板DNA分別用Identifiler、Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行29cycles、32cycles擴(kuò)增，電泳結(jié)果做比較分析。棉簽上的血斑用于比較Identifiler Plus與Identifiler擴(kuò)增試劑盒對血紅素的抗抑制作用，因此血斑剪取較大取5mm×5mm面積。綠色葉子上血斑、泥土上的血斑、深色布料上血斑用于比較Identifiler Plus與Identifiler擴(kuò)增試劑盒對多糖、多酚，腐殖酸、染料的抗抑制作用，因此血斑取3mm×3mm面積，而載體部分多剪取3mm×3mm面積。

1.4 PCR擴(kuò)增

按照Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒與Identifiler擴(kuò)增試劑盒的操作手冊進(jìn)行， PCR反應(yīng)體系總體積為10μL。

1.5 STR分型檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析，在ABI3130XL遺傳分析儀上完成。

2 結(jié)果和討論

法醫(yī)檢驗(yàn) DNA樣本大多來自于犯罪現(xiàn)場，由于環(huán)境的復(fù)雜多變，很多檢材都含有各種污染物、雜質(zhì)。這些物質(zhì)或多或少會對下游的PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致擴(kuò)增的不平衡，等位基因的丟失，甚至使整個(gè)擴(kuò)增過程失敗。血斑中的血紅素、土壤中的腐殖酸、綠色葉子中的多糖、多酚，深色布料中的染料[1]，這些因素都會對擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，從而使后續(xù)的PCR反應(yīng)部分或者完全失敗。圖1為棉簽血斑模板DNA梯度擴(kuò)增后電泳結(jié)果，5%Chelex-100孵育變性后的溶液呈深紅褐色，溶液中存在大量的血紅素，血紅素中的鐵離子能夠競爭性的干擾鎂離子與Tag酶的結(jié)合影響PCR反應(yīng)。圖中表明，當(dāng)加入2μL模板DNA時(shí)，ID擴(kuò)增后電泳結(jié)果有一半基因座未能檢出，而IDPlus在加入5μL模板DNA時(shí)，15個(gè)基因座全部得出完整分型。圖2為泥土上的血斑模板DNA梯度擴(kuò)增后電泳結(jié)果，5%Chelex-100孵育變性后的溶液呈黃褐色，土壤中含有大量的腐殖酸，而腐殖酸在比較低的濃度就可以與模板DNA、Tag酶發(fā)生相互作用影響擴(kuò)增反應(yīng)。圖中表明，當(dāng)加入2μL模板DNA時(shí)，ID擴(kuò)增后電泳結(jié)果只有少數(shù)幾個(gè)基因座檢出，而 IDPlus在加入 5μL模板DNA時(shí)，15個(gè)基因座全部得出完整分型。圖3為深色布料上血斑模板DNA梯度擴(kuò)增后電泳結(jié)果，5%Chelex-100孵育變性后的溶液呈深藍(lán)色，溶液中存在大量的藍(lán)色染料。染料可以競爭性的干擾引物結(jié)合位點(diǎn)以及抑制Tag酶活性。圖中表明，當(dāng)加入2μL模板DNA時(shí)，ID擴(kuò)增后電泳結(jié)果有一多半基因座未能檢出，而IDPlus在加入5μL模板DNA時(shí)，15個(gè)基因座全部得出完整分型。

圖1 血斑中的血紅素對ID、IDplus擴(kuò)增的影響

圖2 泥土中的腐植酸對ID、IDplus擴(kuò)增的影響

圖3 深色布料中染料對ID、IDplus擴(kuò)增的影響

圖4 植物中多糖、多酚對ID、IDplus擴(kuò)增的影響

圖4為綠色葉子上血斑模板DNA梯度擴(kuò)增后電泳結(jié)果，5%Chelex-100孵育變性后的溶液呈綠色，植物中含有大量多糖、多酚、膠質(zhì)、木聚糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠協(xié)同抑制PCR。圖中表明，當(dāng)加入3μL模板DNA時(shí)，ID擴(kuò)增后電泳結(jié)果只有少數(shù)幾個(gè)基因座檢出，而IDPlus在加入5μL模板DNA時(shí)，15個(gè)基因座全部得出完整分型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Identifiler Plus與Identifiler擴(kuò)增試劑盒相比對血紅素、多糖、多酚、膠質(zhì)、木聚糖、腐殖酸、染料等具有更強(qiáng)的抗抑制作用。由于Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒對buffer進(jìn)行了改進(jìn)，加入了增強(qiáng)劑及抗抑制劑成分[2]，一些增強(qiáng)劑的加入比如 Tween20、二甲基亞砜、聚乙二醇等可以抵制 PCR抑制劑的作用。Identifiler Plus引物的合成工藝也進(jìn)行了改善，而且采用了催化活性更強(qiáng)的聚合酶，所以Identifiler Plus與Identifiler擴(kuò)增試劑盒相比可以耐受更強(qiáng)濃度的各種PCR抗抑制物。從電泳結(jié)果中還可以看到Identifiler Plus擴(kuò)增后等位基因的峰高、峰的面積也要大于Identifiler。表1結(jié)果為4份低模板降解DNA樣本分別用 Identifiler、Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行29cycles、32cycles擴(kuò)增后電泳結(jié)果，可以看出在29cycles，3個(gè)樣本使用Identifiler、Identifiler Plus擴(kuò)增后都只得到了部分基因座分型，而 Identifiler Plus等位基因的丟失要好于Identifiler。另外 1 個(gè)樣本 29cycles下 Identifiler、Identifiler Plus都沒有檢出基因座分型。當(dāng)把循環(huán)數(shù)加到32個(gè)時(shí)，Identifiler Plus與Identifiler相比，4個(gè)樣本都得到了更多的基因座分型，而同樣Identifiler Plus等位基因的丟失要好于Identifiler。結(jié)果表明對于低模板降解DNA樣本Identifiler Plus能夠檢出更多的等位基因分型，更少的等位基因丟失。綜上所述，Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒與Identifiler擴(kuò)增試劑盒相比具有更好的抗PCR抑制物作用、對于降解DNA低模板DNA樣本具有更高的靈敏度。

表1 ID、IDplus分別擴(kuò)增29、32個(gè)循環(huán)電泳結(jié)果比較

[1] 鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M]. 北京: 中國人民公安大學(xué)出版社, 2002.

[2] Deneis Y. Wang, Chien-WeiChang, Robet E,Lagace, et al. Developmental validation of the amp FLSTRRIdentifiler plusRPCR amplification kit: An established multiplex assay with improved performance[J]. J Forensic Sci,2012, 57(2): 453-465