左玉，李鵬鴿，朱瑞濤，張彩鳳，謝文磊

1(太原師范學(xué)院化學(xué)系，山西太原，030031)2(河南工業(yè)大學(xué)化學(xué) 化工學(xué)院，河南 鄭州，45001)

植物甾醇是天然植物中的一種活性成分，具有良好的生物活性和特有的物理化學(xué)性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和化工等行業(yè)，是全世界最受關(guān)注的功能性食品因子之一［1－3］。人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40多種較為主要的植物甾醇，在各種植物甾醇中，含量最多的是谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇［4］。多項(xiàng)研究表明，大部分植物甾醇具有一定的抗氧化能力。

目前，有關(guān)植物甾醇中的豆甾醇的性質(zhì)和作用已有很多文章進(jìn)行了綜述，但對(duì)其抗氧化活性的研究，特別是在如生物膜這樣的復(fù)雜體系下用多種抗氧化指標(biāo)對(duì)豆甾醇抗氧化活性的研究鮮有文章予以總結(jié)。為了解豆甾醇在生物體系中的抗氧化作用，本研究用大豆磷脂脂質(zhì)體模擬非均相生物體系，用水溶性的偶氮化合物AAPH熱分解生成的自由基引發(fā)脂質(zhì)氧化，通過硫氰酸鐵法(FCT)和硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(TBARS)檢測脂質(zhì)的氧化進(jìn)程，研究豆甾醇的抗氧化活性以及VC和VE對(duì)其抗氧化活性的影響。以期明確豆甾醇及其協(xié)同作用的抗氧化機(jī)理，為進(jìn)一步應(yīng)用于生命體的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆甾醇(stigmasterol，95%)，大豆磷脂，2，2-偶氮(2-脒基丙烷)、HCl，叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)(純度＞97%)，抗壞血酸(VC)，α-生育酚(VE)，F(xiàn)eCl2·4H2O(含量 ＞ 99.7%)，2-硫代巴比妥酸(TBA)，三氯乙酸(TCA)，NH4SCN(含 量 ＞ 98.5%)，NaH2PO4，Na2HPO4，NaCl，三氯甲烷、無水乙醇。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器

SHZ-C水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市華鋒儀器有限公司;722S型分光光度計(jì)，鞏義市英裕予華儀器廠;KQ-100超聲波清洗儀，鞏義市英裕予華儀器廠;SHZ-DA(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市英裕予華儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52C，鞏義市英裕予華儀器廠;80-1型離心沉淀機(jī)，江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司;TL80-2型醫(yī)用離心機(jī)，江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司;101-2S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠;BS224S萬分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;微量加樣器(10～100 μL)，上海青花儀器廠;微量加樣器(100～500 μL)，上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 主要試劑的配制方法

1.3.1 磷酸鹽緩沖液的配制

稱取 Na2HPO44.799 1 g，NaH2PO41.029 7 g，NaCl 8.500 g加二次蒸餾水溶解定容至1 000 mL(0.02 mol/L)，pH 7.4(21 ℃)。

1.3.2 AAPH溶液的配制

稱取0.500 0 g AAPH，加緩沖溶液溶解定容至100 mL。

1.3.3 Tween 20的配制

稱取5.000 0 g Tween20，加緩沖溶液溶解定容至250 mL。

1.3.4 FeCl2、NH4SCN溶液的配制

稱取0.994 0 g FeCl2·4H2O，用25 mL濃 HCL(36% ～38%)溶解，然后用二次蒸餾水定容至250 mL，振蕩搖勻。

稱取75 g NH4SCN，加二次蒸餾水溶解定容至250 mL。

1.3.5 TBA儲(chǔ)備液的配制

稱取0.720 0 g硫代巴比妥酸(TBA)，加二次蒸餾水溶解(可加熱助溶)定容至250 mL;再稱取50 g三氯乙酸(TCA)，加二次蒸餾水溶解并定容至250 mL。然后將TBA與TCA按1∶1混合均勻，置于棕色瓶中備用。

1.3.6 TBHQ溶液的配制

稱取0.200 0 g TBHQ，加二次蒸餾水溶解定容至250 mL。

1.3.7 豆甾醇溶液的配制

稱取0.008 0 g豆甾醇，用CHCl3溶解至100 mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大豆磷脂脂質(zhì)體的制備

大豆磷脂脂質(zhì)體的制備參考Aihua等人的薄膜法［5］進(jìn)行。稱取10.0 g大豆磷脂，用CHCl3溶解定容至250 mL(40 mg/mL)，儲(chǔ)存于冰箱中備用。再量取10.0 mL磷脂的CHCl3溶液于100 mL圓底燒瓶中，45℃減壓蒸去CHCl3，加入一定量的磷酸鹽緩沖溶液，在超聲波振蕩器中振蕩20 min，制備脂質(zhì)體，脂質(zhì)體溶液呈乳白色不透明狀。在測定豆甾醇抗氧化性能時(shí)，豆甾醇的氯仿溶液預(yù)先與磷脂溶液混合，然后減壓蒸去CHCl3。

1.4.2 脂質(zhì)的氧化

本研究采用AAPH作為引發(fā)劑，加速大豆磷脂脂質(zhì)體的氧化。

向大豆磷脂脂質(zhì)體分散液中加入0.5 mL AAPH后，置于水浴恒溫振蕩器中(轉(zhuǎn)速約為175 r/min)，恒溫37℃發(fā)生氧化反應(yīng)。在脂質(zhì)體中抗氧化劑的添加量分別為0.001 6、0.004、0.008 mg/mL(濃度相當(dāng)于磷脂質(zhì)量的0.02%、0.05%、0.10%)，分別考查不同濃度豆甾醇對(duì)大豆磷脂脂質(zhì)體氧化的影響。按照方法1.4.3，每隔1.5 h定時(shí)取樣進(jìn)行分析，用FTC法和TBARS法檢測脂質(zhì)的氧化進(jìn)度，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均采用同一規(guī)格的儀器進(jìn)行操作，且每組實(shí)驗(yàn)均作雙份平行樣，重復(fù)做3次，結(jié)果以平均值表示。

1.4.3 抗氧化活性的測定

1.4.3.1 硫氰酸鐵法(ferric thiocyanate method，F(xiàn)TC)

實(shí)驗(yàn)采用 Mitsuda［6］和 Yen 等［7］的方法。每隔1.5 h取0.1 mL的反應(yīng)液，加入4.7 mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇與0.1 mL 300 mg/mL NH4SCN，再加入0.1 mL 0.02 mol/L的FeCl2/3.5%HCl溶液，室溫反應(yīng)3 min，于500 nm處測吸光度。吸光度值與過氧化物的量符合朗伯-比爾定律。

1.4.3.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(Thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS)

采用Kosugi等人的方法測定MDA［8］，并稍有改動(dòng)。具體步驟如下:每隔1.5 h取0.5 mL的反應(yīng)液，加入2 mL 2.8 mg/mL的 TBA、2 mL 200 mg/mL的TCA并和1 mL 0.8 mg/mL的TBHQ(為了防止脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與TBA共熱時(shí)分解繼續(xù)生成可與TBA反應(yīng)物質(zhì)，在加熱時(shí)可加TBHQ以終止氧化反應(yīng))。然后，置于沸水浴加熱20 min，自來水冷卻約10 min，加入2 mL CHCl3后，3 000 r/min離心10 min。取上清液在532 nm處測其吸光度。

1.5 抑制率的計(jì)算

其中，ODt空白和 ODt樣品分別為 t時(shí)間空白試驗(yàn)和對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)被測樣品的吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每次實(shí)驗(yàn)至少平行進(jìn)行3次，采用Microsoft Excel和Origin 8.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，采用單因素方差分析(ANOVA)。對(duì)各組數(shù)據(jù)采用方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度豆甾醇抗氧化活性的比較

在大豆磷脂脂質(zhì)體中，不同濃度的豆甾醇均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，但2種方法所得的結(jié)果并不相同。這說明豆甾醇可以作為一種抗氧化劑應(yīng)用于生命體系。也曾有研究者發(fā)現(xiàn)，像橄欖油、玉米胚芽油及小麥胚芽油這些油類物質(zhì)中富含植物甾醇，因而能使部分油脂如紅花籽油保護(hù)其脂肪酸不發(fā)生氧化降解，顯示出一定的抗氧化活性。芬蘭Lampi等人［9］的研究也表明了如豆甾醇、谷甾醇等的植物甾醇在高溫條件下對(duì)高油酸葵花籽油具有一定的抗氧化能力。而且，這種抗氧化效果與其自身分子結(jié)構(gòu)和所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)表明，豆甾醇的加入量與吸光度值變化量之間不存在數(shù)值依賴關(guān)系，并不是加入的豆甾醇越多，對(duì)脂質(zhì)氧化的抑制程度越高。圖1-A所示的FTC法中，3種濃度抗氧化活性強(qiáng)弱順序?yàn)?0.008 mg/mL＞0.001 6 mg/mL＞0.004 mg/mL，抑制率分別是37.21%、36.63%和34.88%(顯著性分析結(jié)果表明P＜0.05，以下均相同)。圖1-B所示的TBARS法中，濃度為0.004 mg/mL的添加量表現(xiàn)出最佳的抗氧化能力，其次為0.008 mg/mL的添加量，添加量最少的濃度相應(yīng)抗氧化活性最小。抑制率按濃度由小到大的排列順序?yàn)?52.55%(0.001 6 mg/mL)、61.31%(0.004 mg/mL)和 56.20%(0.008 mg/mL)。

圖1 不同濃度豆甾醇在大豆磷脂脂質(zhì)體中對(duì)脂質(zhì)過氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.1 Effect of different concentrations of stigmasterol on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μM AAPH at 37℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.A control was without sample

分析豆甾醇的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，豆甾醇的不飽和度較高，易形成穩(wěn)定的自由基，阻止脂肪酸鏈的氧化反應(yīng)，其機(jī)制可參考圖2所示。

2.2 不同濃度豆甾醇和VC共同作用時(shí)的抗氧化活性

抗氧化劑的協(xié)同作用是指多種抗氧化劑的復(fù)合體的抗氧化效果強(qiáng)于單一抗氧化劑的抗氧化效果。協(xié)同作用不是抗氧化劑復(fù)合體中各個(gè)抗氧化成分抗氧化性能的簡單加合或相乘，而是它們?cè)诓煌矫姘l(fā)揮不同作用，使整個(gè)復(fù)合體的抗氧化效果增強(qiáng)。

圖2 豆甾醇的抗氧化機(jī)理Fig.2 The possible anti-lipid oxidation mechanism of stigmasterol.

本研究所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)協(xié)同作用的判定采用如下的兩種分析方法。一為加和法:Y=P(x1+x2)－(Px1+Px2)，其中，P(x1+x2)為抗氧化劑復(fù)合體的抑制率，Px1、Px2分別為復(fù)合體中的單一組分在相同濃度下的抑制率。Y為正值說明存在(正)協(xié)同作用，Y為負(fù)值說明不存在協(xié)同作用(或負(fù)協(xié)同作用)。這種分析方法適用于單一組分的抗氧化活性相差很大的情況。二為直接比較法，一般在單一組分的抗氧化活性相近的情況下使用。若抗氧化劑復(fù)合體的抑制率大于等濃度的單一組分的抑制率，表明存在協(xié)同作用，反之無協(xié)同作用。

對(duì)豆甾醇和0.001 6 mg/mL VC對(duì)大豆磷脂過氧化物生成的抑制作用進(jìn)行了研究(FTC法)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-A。如圖3所示，0.001 6 mg/mL VC，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL 豆甾醇，0.001 6 mg/mL 豆甾醇+0.001 6 mg/mL VC，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VC和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VC在反應(yīng)結(jié)束時(shí)的抑制率分別是24.71%、36.63%、34.88%、37.21%、50.58%、53.78% 和55.81%。在相同濃度豆甾醇的基礎(chǔ)上加入0.001 6 mg/mL VC，抑制率提高了近2倍，脂質(zhì)氧化的進(jìn)程顯著延長。采用加和法考察協(xié)同作用，Y1=50.58%－36.63% －24.71% = －10.76% ＜ 0，Y2=53.78%－34.88% －24.71% = －5.81% ＜ 0，Y3=55.81% －37.21% －24.71%= －6.11% ＜ 0，說明不具有協(xié)同作用。在用FTC法檢測的同時(shí)，采用TBARS法檢測反應(yīng)后期分解產(chǎn)物的生成情況，實(shí)驗(yàn)如圖3-B，上述各濃度抗氧化劑的抑制率分別是49.66%、52.55%、61.31%、56.20%、61.31%、50.96%和49.04%。用加和法檢驗(yàn)其協(xié)同作用:Y1=61.31% －52.55% －49.66% ? 0，Y2=50.96%－61.31% －49.66% ? 0，Y3=49.04% －56.20%－49.66% ?0，Y值均小于0，表明復(fù)合抗氧化劑不顯示協(xié)同作用。

當(dāng)VC的濃度為0.008 mg/mL時(shí)，考察了在大豆磷脂脂質(zhì)體中與豆甾醇的協(xié)同作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖3 不同濃度豆甾醇對(duì)0.001 6 mg/mL VC在大豆磷脂脂質(zhì)體中對(duì)脂質(zhì)過氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.3 Interaction of stigmasterol and ascorbic acid(0.001 6 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

圖4 不同濃度豆甾醇對(duì)0.008 mg/mL VC在大豆磷脂脂質(zhì)體中對(duì)脂質(zhì)過氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.4 Interaction of stigmasterol and ascorbic acid(0.008 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

0.008 mg/mL VC，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL豆甾醇，0.001 6 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VC，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VC和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.008mg/mL VC的抑制率分別是30.23%、36.63%、34.88%、37.21%、37.21%、32.27%和37.21%(圖5)。而TBARS法得到的抑制率分別是 61.31%、52.55%、61.31%、56.20%、23.36%、20.44%和11.68%(圖5)。圖4-A中的氧化曲線的變化情況基本沒有差別，吸光度值和抑制率也相差不大，而在TBARS法中(圖4-B)，VC和豆甾醇共同作用時(shí)的曲線均位于單一VC或豆甾醇的氧化曲線之上，表明復(fù)合抗氧化劑的抗氧化能力均低于單一抗氧化劑，并不顯示協(xié)同增效作用，而是有一定的助氧化作用，說明了抗氧化劑對(duì)氧化初期和終期產(chǎn)物的抑制作用有一定的區(qū)別。

協(xié)同抗氧化過程是抗氧化劑間的一種普遍現(xiàn)象，也是一個(gè)比較復(fù)雜的過程。有研究顯示，β-胡蘿卜素和VE混合后比單一成分對(duì)于防止癌變及抑制早期腫瘤更有效［10］，茶多酚對(duì) VE及 VC都有保護(hù)作用［11－12］等。但其機(jī)理，還有待人們的進(jìn)一步研究。

圖5 不同濃度豆甾醇和VC共同作用時(shí)對(duì)大豆磷脂脂質(zhì)體氧化的抑制率Fig.5 Antioxidant activity of stigmasterol and its interaction with ascorbic acid in soybean PC liposome.

2.3 不同濃度豆甾醇和VE共同作用時(shí)抗氧化活性的研究

圖6、圖7表明了不同濃度的豆甾醇和不同濃度的VE在大豆磷脂脂質(zhì)體中對(duì)脂質(zhì)氧化的影響。從圖6-A中抗氧化劑對(duì)脂質(zhì)過氧化物的抑制作用可得出，0.001 6 mg/mL VE，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL豆甾醇，0.001 6 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VE，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VE和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.001 6 mg/mL VE的抑 制 率 分 別 為 35.76%、36.63%、34.88%、37.21%、47.38%、50.00%和 50.29%(圖 8)。在添加豆甾醇的磷脂脂質(zhì)體中加入0.001 6 mg/mL VE，其抗氧化活性增加，且隨著豆甾醇濃度增加，抗氧化作用也增加。用加和法考察協(xié)同作用:Y1=47.38% －35.76% －36.63%= －25.01% ＜ 0，Y2=50.00% －35.76% －34.88%= －20.64% ＜ 0，Y3=50.29% －35.76% －37.21%=－22.58% ＜0，這說明復(fù)合抗氧化劑不顯示協(xié)同作用。圖6-B所示的TBARS法的結(jié)果卻與FTC法的結(jié)果有較大差異，VE的加入使得532 nm處的吸光度值從反應(yīng)開始時(shí)就開始減小，并始終保持減小的趨勢。在反應(yīng)的最后階段，3種復(fù)合抗氧化劑的吸光度值已降至0.003、0.009和0.012，抑制率分別是93.27%、89.42%和63.46%，由于吸光度值的變化趨勢不符合一般規(guī)律，無法從抑制率的大小來判斷復(fù)合抗氧化劑抗氧化活性的強(qiáng)弱以及體系中是否存在抗氧化協(xié)同增效作用，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因尚不清楚。

圖6 不同濃度豆甾醇和0.0016 mg/mL VE在大豆磷脂脂質(zhì)體中對(duì)脂質(zhì)過氧化物(FTC)(A)和對(duì)MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.6 Interaction of stigmasterol and α-tocopherol(0.0016 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μM AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

0.008 mg/mL VE與不同濃度豆甾醇共同作用的結(jié)果如圖7所示。由圖7-A中FTC法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出，0.008 mg/mL VE，0.001 6、0.004、0.008 mg/mL豆甾醇，0.001 6 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VE，0.004 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VE和0.008 mg/mL豆甾醇 +0.008 mg/mL VE的抑制率分別為40.70%、36.63%、34.88%、37.21%、54.05%、56.63%和57.61%(圖8)。以加和法考察其協(xié)同作用，Y1=54.05% －40.70% －36.63%=－33.28%＜0，Y2=56.63% －40.70% －34.88%= －18.95%＜0，Y3=57.61% －40.70% －37.21%= －20.30%＜0，說明復(fù)合抗氧化劑不顯示協(xié)同增效作用。由圖7-B中TBARS法的試驗(yàn)結(jié)果可得，上述各濃度抗氧化劑的抑制率分別是51.82%、55.25%、61.31%、56.20%、75.00%、71.15%和69.23%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.008 mg/mL VE的加入，增加了復(fù)合物的抗氧化能力，雖然在反應(yīng)的7.5～9 h，F(xiàn)TC法和TBARS法的吸光度值開始呈下降趨勢，2種抗氧化劑的總抗氧化活性有所下降，但與單一豆甾醇的抗氧化活性相比，仍具有較好活性。

圖7 不同濃度豆甾醇和0.008 mg/mL VE在大豆磷脂脂質(zhì)體中對(duì)脂質(zhì)過氧化物(FTC)(A)和對(duì)MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.7 Interaction of stigmasterol and α-tocopherol(0.008 mg/mL)on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.

圖8 不同濃度豆甾醇和VE對(duì)大豆磷脂脂質(zhì)體氧化的抑制率Fig.8 Antioxidant activity of stigmasterol and its interaction with α-tocopherol in soybean PC liposome.

3 結(jié)論

用大豆磷脂脂質(zhì)體模擬非均相生物體系，用FTC法和TBARS法研究豆甾醇在非均相體系中的抗氧化活性，并考察了VC和VE對(duì)其抗氧化活性的影響，結(jié)果表明:在大豆磷脂脂質(zhì)體中，不同濃度豆甾醇均具有抗氧化活性，但不同體系中其抗氧化活性并不相同。此外，在大豆磷脂脂質(zhì)體中，TBARS法測得0.001 6 mg/mL VE的加入使復(fù)合抗氧化劑抑制脂質(zhì)氧化后期產(chǎn)物生成的量隨時(shí)間增長呈下降趨勢。

這說明豆甾醇作為抗氧化劑具有較好的應(yīng)用前景。對(duì)其藥理學(xué)、毒理研究，對(duì)于食品科學(xué)、生命科學(xué)和深入理解抗氧化劑的保健功能具有重要意義。

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