伍志蓮，賴書臺

(韶關(guān)市曲江區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東 韶關(guān)512100)

2011年美國癌癥學(xué)會(American Cancer Society，ACS)最新發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計報告稱，食管、胃、肝臟、結(jié)直腸等消化系統(tǒng)臟器的癌癥發(fā)生率和死亡率在發(fā)展中國家均占前十位[1]。上消化道出血量小于5ml時肉眼看不到血液存在；紅細(xì)胞受到破壞時，糞便顯微鏡檢查也見不到紅細(xì)胞；此時只有通過糞便隱血試驗才能證明有無出血。在臨床的日常診療中糞便隱血試驗非常重要。許多臨床研究證明，糞便微量出血是結(jié)腸直腸癌最早期的癥狀。所以對糞便中微量出血的檢出尤其是在胃腸消化道腫瘤及出血的早期診斷方面具有十分重要的意義。我們在臨床檢驗工作中經(jīng)常遇到黑色柏油樣糞便隱血試驗陰性，而臨床上高度懷疑上消化道出血的情況。為了解其原因，我們做了膠體金免疫法和氨基比林半定量法(化學(xué)法)的糞便隱血試驗對比，并對其結(jié)果進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2013年1月至2014年12月間我院住院及門診確診為上消化道出血的患者的黑色柏油樣糞便100例，同時段正常外觀黃色軟糞便100例(健康者提供)?；颊吣挲g在25~90歲之間，平均年齡45歲，男61例，女39例。

1.2 試劑

1.2.1 便隱血(FOB)檢測試劑(膠體金法)由艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司提供。

1.2.2 氨基比林半定量法 (化學(xué)法)試劑：(1)5%氨基比林溶液：稱取氨基比林5克溶于50ml冰醋酸和50ml無水乙醇的混合液中搖勻，置棕色瓶中保存。(2)3%過氧化氫溶液：吸取10ml30%過氧化氫溶液加90ml蒸餾水混勻。置棕色瓶中保存(注意3%過氧化氫容易失效，試驗時應(yīng)做陽性對照)。

1.3 方法

1.3.1 便隱血(FOB)檢測試劑(膠體金法)檢測原理采用雙抗體夾心法，試劑含有被事先固定于膜上檢測區(qū)(T)的抗人血紅蛋白和質(zhì)量控制區(qū)(C)的相應(yīng)抗體。測試時，試劑插入樣本中，隨之在毛細(xì)效應(yīng)作用下向上層析。如果糞便中含有人血紅蛋白，則形成金標(biāo)記抗人Hb單抗-糞Hb-羊抗人Hb多抗復(fù)合物[2]，在檢測區(qū)(T)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帶(陽性結(jié)果)。如果糞便中無人血紅蛋白，則檢測區(qū)(T)內(nèi)將無紫紅色條帶。無論人血紅蛋白是否存在于樣本中，一條紫紅色帶都會出現(xiàn)在質(zhì)量控制(C)內(nèi)。質(zhì)量控制區(qū)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判斷是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。檢測方法及注意事項均嚴(yán)格按試劑說明書操作，試劑在有效期內(nèi)使用。操作：在樣品杯中加入約0.5ml蒸餾水，用竹簽挑取約火柴頭大小的新鮮糞便標(biāo)本放入杯內(nèi)混勻；從包裝紙中取出試劑條，將試劑條的箭頭所指端浸入樣本溶液中 (液面不能超過MAX標(biāo)記線)，5~10min判讀結(jié)果。

1.3.2 氨基比林半定量法(化學(xué)法)原理 血紅蛋白中的亞鐵血紅素有類似過氧化物酶的活性，能催化H2O2作為電子受體使氨基比林氧化而顯紫藍(lán)色，其顏色的深淺與血紅蛋白含量成正比。操作：用竹簽挑取約火柴頭大小的新鮮糞便標(biāo)本，置于白色背景上，依次加2~3滴5%氨基比林溶液，2~3滴3%過氧化氫溶液。立即觀察結(jié)果，在2min內(nèi)出現(xiàn)紫藍(lán)色為陽性。并根據(jù)顏色深淺記錄(以“+”表示)。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料采用率表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常外觀黃色軟便膠體金免疫法陽性率為8%(8/100)，氨基比林半定量法陽性率為2%(2/100)，兩種方法同時陽性為0；黑色柏油樣便膠體金免疫法陽性率為77%(77/100)，氨基比林半定量法陽性率為100%，膠體金法與氨基比林半定量法隱血試驗的陽性率對照差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，見表 1。

表1 糞便隱血2種方法結(jié)果

3 討論

美國臨床化學(xué)學(xué)會[3]和中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會[4]均推薦糞便隱血試驗作為結(jié)直腸癌的篩查指標(biāo)。糞便隱血試驗的方法主要有化學(xué)法、免疫法、血紅蛋白熒光測定法、放射性核素鉻(51Cr)法、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)法等?；瘜W(xué)法主要包括鄰聯(lián)甲苯胺法、氨基比林法、愈創(chuàng)木酯法等；西班牙學(xué)者研究提示免疫法糞便隱血試驗是目前結(jié)直腸癌篩查的最適合手段[5]。目前臨床采用較多的免疫法是單抗免疫膠體金法，該方法被世界衛(wèi)生組織胃腸鏡檢查協(xié)會推薦為糞便隱血試驗的一種較為確認(rèn)的方法[6]。其原理是膠體金是由氯化金和枸櫞酸合成的膠體物質(zhì)，呈紫紅色。膠體金與羊抗人血紅蛋白單克隆抗體(羊抗人Hb單抗)和鼠IgG吸附在特制的乙酸纖維膜上，形成一種有標(biāo)記抗體的膠體金物質(zhì)，再在試帶的上端涂上包被羊抗人Hb多抗和羊抗鼠IgG抗體[2]作為試劑質(zhì)控對照線。氨基比林半定量法的特點(diǎn)是中靈敏度、中特異性，Hb 1~5mg/L即可檢出，消化道有5~10ml出血即為陽性[2]。從表1可以看出當(dāng)糞便外觀呈正常黃軟便時氨基比林半定量法陽性有2例，膠體金免疫法陽性有8例。兩種方法同時陽性為0；可見膠體金免疫法靈敏度高于氨基比林半定量法，當(dāng)糞便外觀呈黑色柏油樣便時氨基比林半定量法陽性100例(100%)，膠體金免疫法陽性77例(77%)。此時氨基比林半定量法的靈敏度高于膠體金免疫法?？梢姲被攘职攵糠梢詽M足臨床需求。

表中還可看出，在黑色柏油樣糞便中膠體金免疫法有23例陰性。說明膠體金免疫法存在假陰性。其原因可能有以下幾個方面：上消化道出血量大時Hb濃度過高，Hb、Hb-Hb抗體復(fù)合物和抗Hb競爭結(jié)合，抑制了膠體金顆粒聚集(后帶現(xiàn)象)，導(dǎo)致假陰性[7]，此時可稀釋糞便標(biāo)本再復(fù)查；患者的血紅蛋白抗原與單克隆抗體不相匹配而出現(xiàn)假陰性[8]；糞便標(biāo)本中的紅細(xì)胞或Hb在消化道內(nèi)時間較長時，珠蛋白鏈可能會被胃液及蛋白酶水解和降解破壞，從而失去能特異結(jié)合單克隆抗體的抗原決定簇，使其失去免疫原性而出現(xiàn)假陰性[9]；還有可能觸珠蛋白和糖化血紅蛋白等屏蔽抗原決定簇從而引起假陰性；此外，胃腸道內(nèi)的各種細(xì)菌作用也有可能使血紅蛋白失去免疫活性，導(dǎo)致假陰性。

化學(xué)法隱血試驗易受多種因素影響而呈假陽性反應(yīng)[10]。試驗結(jié)果顯示，黃色軟便中氨基比林半定量法陽性2例，可能是食入動物肉類、鐵劑等產(chǎn)生的假陽性；膠體金免疫法陽性8例臨床證實有不同程度的胃潰瘍、痔瘡等。總之，在臨床診療中必須了解各種方法的局限性。如免疫法不受動物血紅蛋白的干擾，而化學(xué)法無法排除此干擾[11]，林召等[12]認(rèn)為免疫金標(biāo)法隱血試驗主要檢測下消化道出血,約有40%~50%的上消化道出血不能檢出，高于本文的23%。由于免疫法只能定性檢測，而化學(xué)法大致能估計出血量(半定量)，且利于觀察消化道出血病人的療效。因此,化學(xué)法檢查上消化道出血(胃、十二指腸等)可靠[13]。膠體金免疫法的特異性只針對糞便中的人血紅蛋白,當(dāng)樣品中血紅蛋白濃度超過0.2μg/ml時，就可得到陽性結(jié)果[14]，而且此實驗不受其它動物肉類血紅蛋白干擾，含過氧化物酶的新鮮蔬菜,鐵劑,維生素C及對化學(xué)法有干擾作用的某些藥物對此法的結(jié)果均無影響[15]。所以在日常臨床工作中應(yīng)該以膠體金法作為主要隱血檢測手段[16]。當(dāng)黑色柏油樣便膠體金法陰性時，可以通過氨基比林半定量法(化學(xué)法)糾正結(jié)果，以提高糞便隱血的準(zhǔn)確性。

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