陳祖兵 李蔚 沈世強 胡超 譚冠

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異甘草酸鎂聯(lián)合維拉帕米對大鼠肝切除肝缺血再灌注損傷的作用研究

陳祖兵 李蔚 沈世強 胡超 譚冠

目的 研究異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)聯(lián)合維拉帕米(verapamil,異搏定)對肝切除肝缺血再灌注損傷的作用。方法 雄性SD大鼠隨機分為假手術組(A組)、50%肝切除肝缺血再灌注損傷組(B組)、50%肝切除肝缺血再灌注損傷+MgIG治療組(C組)、50%肝切除肝缺血再灌注損傷+ verapamil治療組(D組)、50%肝切除肝缺血再灌注損傷+ MgIG聯(lián)合verapamil治療組(E組)。觀察各組大鼠肝臟功能、形態(tài)學、超氧化物歧化酶(SOD)活性及FasL的表達情況。結果 與B組比較，E組病理改變明顯減輕，各時間點血清丙氨酸轉氨酶(ALT)水平顯著下調(P<0.05)，肝組織SOD活性明顯增強(P<0.05)， FasL蛋白表達明顯下調(P<0.05)。結論 異甘草酸鎂聯(lián)合維拉帕米能有效減輕肝切除肝缺血再灌注損傷。其對肝細胞的保護作用可能是通過抑制Fas/FasL系統(tǒng)介導的凋亡反應，減輕肝臟過氧化損傷而實現(xiàn)。

異甘草酸鎂；維拉帕米；大鼠；肝切除；肝缺血再灌注損傷

行復雜的肝臟外科手術時常發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)，HIRI發(fā)生機制較為復雜[1-2],可造成肝細胞凋亡、壞死，是影響病人術后肝功能恢復及長期存活的重要因素。異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)是一種新的肝細胞保護劑，能夠抗炎并降低肝酶，有研究認為，MgIG 能夠減輕CCl4導致的肝細胞損傷[3]。維拉帕米verapamil異搏定是選擇性的鈣離子通道阻滯劑，通過降低細胞炎癥因子的水平從而減輕肝細胞損傷[4]。本文觀察MgIG聯(lián)合verapamil應用對大鼠肝切除肝缺血再灌注損傷保護作用的保護作用，并探討其機制，為臨床肝切除肝缺血再灌注損傷的防治提供新的思路。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物 健康雄性SD大鼠100只，體質量235～315 g,購自武漢大學實驗動物中心。

2.主要試劑 異甘草酸鎂注射液10 ml∶50 mg由江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司提供，維拉帕米(verapamil，異搏定)5 mg/2 ml購自上海禾豐制藥有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

二、方法

1.大鼠50%肝切除肝缺血再灌注損傷模型制備 實驗大鼠術前12 h禁食，自由飲水。水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg體重)，固定后消毒，取腹正中切口入腹，解剖分離肝臟韌帶，充分暴露第一肝門。切除占肝體積約30%的肝左葉。以無創(chuàng)血管夾阻斷約占肝體積50%的中葉及尾狀葉血管45 min，保留占肝體積20%的肝右上、下葉作為門靜脈與腔靜脈之間血液回流的通道。45 min后進入腹腔移去血管夾，切除未作處理的肝右上、下葉，建立50%肝切除肝缺血再灌注損傷模型。

2.實驗分組 將100只雄性SD大鼠隨機分為5組: 假手術組(A組)、缺血再灌注組(B組)、MgIG組(C組)、verapamil組(D組)、MgIG+ verapamil組(E組)。每組各20只，各組按缺血再灌注時間點6 h、12 h、24 h、48 h分為4個亞組，每組5只。假手術組：僅開腹分離肝十二指腸韌帶，不作肝臟切除及血管阻斷，注射同容積的生理鹽水。缺血再灌注組：行50%肝切除肝缺血再灌注損傷手術，注射同容積的生理鹽水。MgIG治療組：手術處理同B組，于術前30 min腹腔注射異甘草酸鎂30 mg/kg。verapamil治療組：手術處理同B組，于開腹前10 min尾靜脈注射維拉帕米注射液1.25 mg/kg。MgIG+ verapamil治療組：手術處理同B組，分別于開腹前30 min腹腔注射異甘草酸鎂30 mg/kg ,術前10 min尾靜脈注射維拉帕米注射液1.25 mg/kg。

3.大鼠肝功能檢測 各組于實驗完成后6 h、12 h、24 h、48 h抽取大鼠眼內眥靜脈血，離心后取血清，送標本至武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉氨酶(ALT)水平。

4.大鼠肝組織SOD活性檢測 肝組織勻漿后以黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，結果以每克肝組織中硝酸鹽單位(NU/g)表示。

5.光鏡下觀察大鼠肝臟形態(tài)學變化 再灌注后12 h取肝臟組織雙蒸水沖洗、脫水、透明處理、浸于石蠟包埋，做石蠟切片，進行HE染色，OLYMPUS光學顯微鏡于×400倍下照相，觀察各組肝細胞形態(tài)學變化。

6.免疫組織化學染色檢測肝組織凋亡相關基因(FasL)表達 取經甲醛固定的大鼠肝臟組織石蠟切片脫蠟染色，染色按說明書進行。在顯微成像系統(tǒng)下(10×40倍)攝片,以Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)校正，分析測定累計吸光度及面積兩參數(shù)，計算陽性表達平均吸光度。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、光鏡觀察各組大鼠形態(tài)結構的改變

假手術組肝細胞排列正常，未見明顯病理改變。缺血再灌注組可見肝細胞排列紊亂，大量肝細胞壞死。MgIG組、verapamil組可見肝細胞壞死減少，較缺血再灌注組病理改變減輕。MgIG+ verapamil組肝細胞無明顯壞死，病理改變較MgIG組、verapamil組減輕。

二、各組大鼠血清ALT水平及肝組織SOD活性變化

如圖1所示，MgIG+ verapamil聯(lián)合用藥能明顯降低肝切除肝缺血再灌注損傷大鼠血清ALT水平，缺血再灌注組、MgIG組、verapamil組、MgIG+ verapamil組相比于假手術組，各時間點血清ALT水平于肝切除肝缺血再灌注后均明顯增高(P<0.05)，且均在再灌注24 h達到高峰。術后6 h、12 h、24 h、48 h, MgIG組、verapamil組、MgIG+ verapamil組ALT水平均明顯低于缺血再灌注組組(P<0.05)，MgIG+ verapamil組ALT水平分別明顯低于MgIG組、verapamil組(P<0.05)。

如圖2所示，MgIG+verapamil聯(lián)合用藥能明顯增強肝切除肝缺血再灌注損傷大鼠肝組織SOD活性。術后6 h，缺血再灌注組、MgIG組、verapamil組、MgIG+verapamil組SOD活性均明顯低于假手術組(P<0.05)，MgIG組、verapamil組SOD活性明顯高于缺血再灌注組(P<0.05)，MgIG+verapamil組SOD活性明顯高于MgIG組、verapamil組(P<0.05)。

圖1 大鼠血清ALT水平

※與假手術組相比,分別t=10.03,8.09,7.77,4.71,※P<0.05;#與缺血再灌注組相比,分別t=3.82,4.02,8.88,#P<0.05;△與MgIG組相比,t=5.59,△P<0.05,△與verapamil組相比,t=5.00,△P<0.05圖2 大鼠肝組織SOD活性

三、免疫組織化學檢測各組大鼠肝組織FasL蛋白的表達

以觀察到細胞質棕黃色染色為FasL的表達陽性。假手術組未見明顯FasL陽性染色，缺血再灌注組可見細胞胞質呈彌漫性強陽性染色，陽性染色明顯強于假手術組，MgIG組、verapamil組、MgIG+ verapamil組Fasl陽性染色明顯弱于缺血再灌注組，但仍然強于假手術組，MgIG+ verapamil組陽性染色明顯弱于MgIG組、verapamil組。見圖3、4。

※與假手術組相比,分別t=11.40,6.15,7.82,6.60,※P<0.05;#與缺血再灌注組相比,分別t=5.53,5.57,8.69,#P<0.05;△與MgIG組相比,t=2.83,△P<0.05,△與verapamil組相比,t=3.71,△P<0.05圖4 FasL陽性表達平均吸光度

討 論

肝臟在正常的生理狀況下具有強大的再生能力，行肝大部切除后殘肝能迅速的恢復功能及體積[5]。然而在臨床上行肝大部切除的病人常常合并肝硬化、肝癌等，肝功能儲備差，肝損傷后再生能力下降，再加上肝切除后缺血再灌注損傷，常導致術后肝功能不全，甚至出現(xiàn)肝衰竭[6]。因此，尋找一種有效的減輕肝臟損傷、促進術后殘肝功能恢復的措施是很有必要的。目前減輕肝臟缺血再灌注損傷的措施主要包括缺血預處理、藥物預處理等，有研究認為藥物預處理的效果及應用前景優(yōu)于缺血預處理[7-8]。

異甘草酸鎂為新一代肝細胞保護劑，是甘草酸的異構體。具有保護細胞膜、抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用。有研究表明，異甘草酸鎂可減輕由Fe-NTA引起的肝星狀細胞氧化損傷,可能有助于肝纖維化的治療[9]。另有研究顯示，異甘草酸鎂可減低肝切除術后急劇增高的肝酶[10]。維拉帕米為罌粟堿的衍生物，是一種電依賴的脂溶性鈣離子拮抗劑，一般于靜脈注射10 min后達到高峰，可阻滯血液中鈣離子進入肝細胞，減輕細胞鈣超載，從而起到保護肝細胞的作用[11-12]。本研究結果顯示，肝切除肝缺血再灌注損傷導致肝臟形態(tài)學損傷，血清ALT水平明顯上調，分別用異甘草酸鎂及維拉帕米治療后肝臟形態(tài)學損傷明顯減輕，ALT水平明顯下調，聯(lián)合用藥后肝臟形態(tài)學損傷較分別單獨用藥進一步減輕，ALT水平明顯下調。這表明異甘草酸鎂聯(lián)合維拉帕米療效較單用藥好，能有效改善肝臟功能，對肝臟起到協(xié)同保護作用。

A:假手術組;B:缺血再灌注組;C:MgIG組;D:verapamil組;E:MgIG+verapamil組圖3 免疫組織化學檢測肝組織FasL蛋白的表達(免疫組織化學染色,×400)

缺血再灌注損傷后可有大量的活性氧(ROS)生成[13], 新生成的ROS可進一步促進線粒體內ROS的生成，ROS具有強氧化作用，引起肝臟發(fā)生脂質過氧化反應，產生MDA等毒性產物破壞生物膜結構、損傷線粒體內呼吸鏈酶復合體，最終導致細胞腫脹和死亡。超氧化物歧化酶(SOD)作為內源性抗氧化酶，能清除氧自由基，對抗機體過氧化損傷,是反映機體抗氧化能力的指標[14]。本研究結果顯示，肝切除肝缺血再灌注損傷后肝組織SOD活性明顯下降，分別用異甘草酸鎂及維拉帕米治療后肝組織SOD活性明顯增強，聯(lián)合用藥后SOD活性進一步增強，表明肝切除肝缺血再灌注損傷時肝臟抗氧化能力下降，聯(lián)合用藥有助于增強機體抗氧化能力，減輕肝臟過氧化損傷，從而起到保護作用。

肝細胞凋亡是許多肝臟疾病的共同的病理學表現(xiàn)，研究顯示肝細胞凋亡在非酒精性脂肪肝、肝纖維化甚至是肝硬化及肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用[15]。死亡受體通路是調控肝細胞凋亡的主要通路之一，F(xiàn)as參與死亡受體信號通路，是一種屬于TNF超家族成員的跨膜蛋白，在細胞凋亡的信號傳導過程中發(fā)揮作用。FasL與Fas相結合組成Fas/FasL系統(tǒng)，通過誘發(fā)凋亡信號的轉導，最終激活凋亡效應分子Caspase-3，作用于細胞的結構蛋白，從而導致細胞凋亡[16]。本實驗結果顯示，肝切除肝缺血再灌注損傷后FasL蛋白表達水平明顯上調。分別用異甘草酸鎂及鈣離子拮抗劑治療后FasL蛋白水平明顯下調。聯(lián)合用藥后Fasl蛋白表達水平進一步下調，提示肝切除肝缺血再灌注損傷時肝臟存在由Fas/FasL系統(tǒng)介導的細胞凋亡,聯(lián)合應用異甘草酸鎂及維拉帕米可能通過降低FasL表達，減少Fas與FasL的結合，減少Caspase-3激活，從而減少肝細胞凋亡。

綜上所述，本研究結果表明，異甘草酸鎂聯(lián)合維拉帕米對肝切除肝缺血再灌注損傷的效果優(yōu)于單用藥，能有效減輕肝切除肝缺血再灌注損傷。其對肝細胞的保護作用可能是通過抑制Fas/FasL系統(tǒng)介導的細胞凋亡反應，增強機體抗氧化能力，減輕肝臟過氧化損傷而實現(xiàn)的。但其具體機制仍需進一步實驗研究。

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Effects of magnesium isoglycyrrhizinate and verapamil on rat liver during ischemia-reperfusion injury after semi-hepatectomy

ChenZubing,LiWei,ShenShiqiang,HuChao,TanGuan.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,RenminHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

ChenZubing,Email:chenzubing@aliyun.com

Objective To explore the effects of isoglycyrrhizinate and verapamil on rat liver during ischemia-reperfusion injury after semi-hepatectomy .Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups of sham-operation (A); 50% hepatectomy plus 45-min hepatic ischemia (B); isoglycyrrhizinate treatment (C); verapamil treatment (D); isoglycyrrhizinate & verapamil treatment (E). The morphology of liver tissues was observed. And the plasma levels of alanine aminotransferase (ALT) and superoxide dismutase (SOD) and the FasL expression in liver tissue were measured.Results Compared with group B, the pathological changes were milder, the serum level of ALT decreased significantly (P<0.05), SOD activity increased in liver tissue (P<0.05) and FasL protein expression declined significantly in group E.Conclusions Isoglycyrrhizinate and verapamil have protective effects against ischemia-reperfusion injury after liver resection. And the protective effects may be mediated by an inhibition of apoptosis caused by Fas/FasL system and blunted liver peroxidation damage.

Isoglycyrrhizinate; Verapamil; Rats; Liver resection; Liver ischemia-reperfusion injury

·論 著·(實驗研究)

中國肝炎防治基金會-天晴肝病研究基金資助課(CFHPC20132117)

430060 武漢，武漢大學人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科

陳祖兵,Email: chenzubing@aliyun.com

R657.4+6

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.02.014

2014-11-03)