張 龍，梁明福，張智英

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 動(dòng)物科技學(xué)院，b 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的構(gòu)建與篩選

張 龍a，梁明福b，張智英a

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 動(dòng)物科技學(xué)院，b 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 構(gòu)建能夠定點(diǎn)轉(zhuǎn)座的高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)?！痉椒ā?以野生型PiggyBac轉(zhuǎn)座酶為模板，通過(guò)易錯(cuò)PCR方法隨機(jī)突變轉(zhuǎn)座酶基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)，并將其與能夠靶向識(shí)別并結(jié)合DNA序列的鋅指蛋白(ZFP)融合表達(dá)，構(gòu)建ZFP-PiggyBac轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)系統(tǒng)。將轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)、轉(zhuǎn)座子載體和報(bào)告載體共轉(zhuǎn)到釀酒酵母JMY1中，通過(guò)Ura-5FOA酵母篩選系統(tǒng)篩選高效定點(diǎn)作用的轉(zhuǎn)座酶?！窘Y(jié)果】 成功構(gòu)建ZFP-PiggyBac轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)3輪系統(tǒng)篩選獲得5個(gè)高效作用的突變轉(zhuǎn)座酶。【結(jié)論】 新構(gòu)建的ZFP-PiggyBac轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)系統(tǒng)具有在鋅指蛋白ZFP靶向識(shí)別域Rosa26BS位點(diǎn)處進(jìn)行高效轉(zhuǎn)座的能力。

5FOA；轉(zhuǎn)座酶；鋅指蛋白

PiggyBac轉(zhuǎn)座子最初由Fraser等[1]從甘藍(lán)蠖度尺蛾基因組中獲得，為Ⅱ型轉(zhuǎn)座子，現(xiàn)在已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)[2]、小鼠胚胎干細(xì)胞遺傳學(xué)操作[3-5]、基因誘變等基因操作[6]、多能干細(xì)胞誘導(dǎo)[7-8]等領(lǐng)域得到應(yīng)用。PiggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座時(shí)特異性地插入TTAA位點(diǎn)[9]，由于其來(lái)源于高等生物昆蟲(chóng)，因而較其他轉(zhuǎn)座子具有更高的活性[10]，沒(méi)有潛在的病毒遺傳毒性，并且可改造性較強(qiáng)；PiggyBac轉(zhuǎn)座子攜帶的外源基因片段較長(zhǎng)，最長(zhǎng)可以攜帶150 kb的目的片段[11]；借助轉(zhuǎn)座酶，PiggyBac轉(zhuǎn)座子可以將目的基因從宿主精確切割敲除，且不會(huì)使宿主染色體發(fā)生重排。這些優(yōu)勢(shì)使得PiggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)基因操作中獲得了廣泛的應(yīng)用。但是，由于PiggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座時(shí)不易控制，易產(chǎn)生隨機(jī)整合且轉(zhuǎn)座效率較低，從而限制了PiggyBac轉(zhuǎn)座子的進(jìn)一步應(yīng)用。

鋅指蛋白(ZFP)存在于多種真核生物中，用于識(shí)別靶位點(diǎn)的DNA結(jié)合域，其能夠以序列特異性的方式與DNA結(jié)合[12-13]，通過(guò)其α螺旋特異性地插入到DNA雙螺旋大溝并與DNA結(jié)合[14]，對(duì)基因調(diào)控起重要作用。由于PiggyBac轉(zhuǎn)座子本身不會(huì)自發(fā)轉(zhuǎn)座，其作用機(jī)制是由PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的切割作用而完成轉(zhuǎn)座[15]，因此通過(guò)提高轉(zhuǎn)座酶活性可以提高轉(zhuǎn)座效率[16-17]，解決其轉(zhuǎn)座效率低及不易受控的缺點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)野生型PiggyBac轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行隨機(jī)突變，同時(shí)在轉(zhuǎn)座酶N端融合表達(dá)能夠特異性識(shí)別DNA序列的ZFP，以期獲得能夠特異性識(shí)別靶位點(diǎn)的高效轉(zhuǎn)座酶，為進(jìn)一步提高外源基因在轉(zhuǎn)基因操作中的位點(diǎn)特異性和安全性提供可能。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 載體構(gòu)建所需質(zhì)粒JMB84-Ura、JMB405、JMB440、pst1374-trans、pst1374-ZFP、JMB440-ZFP-WTtrans、JMB1022-3TR-5TR及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、釀酒酵母菌株JMY1，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶，購(gòu)自NEB公司；pfu高保真酶、easyTaqDNA 聚合酶、dATP、dTTP、dGTP和dCTP，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、酵母提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司；核酸共沉劑，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；5FOA，由寶鑫生物有限公司代購(gòu)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或更高級(jí)別試劑。引物由上海博尚生物技術(shù)公司合成。序列測(cè)定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 轉(zhuǎn)座子載體JMB405-3TR-5TR的構(gòu)建

根據(jù)載體JMB1022-3TR-5TR上轉(zhuǎn)座子序列，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物3TR-F為：5′-GCGAGATCTTTAACCCTAGAAAGATA-ATCA-3′，下游引物5TR-R為：5′-GCGCTCGAG-TTAACCCTAGAAAGATAGTCT-3′ ，3TR-F和5TR-R中下劃線(xiàn)部分分別為BglⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以JMB1022-3TR-5TR質(zhì)粒為模板，采用降落式PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子序列，反應(yīng)體系為：模板2.0 μL，引物3TR-F和5TR-R各0.5 μL，dNTPs 4.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，easyTaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃反應(yīng)30 s，68 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)30 s，16個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度減低1 ℃；94 ℃反應(yīng)30 s，52 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物和JMB405載體分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切并純化回收后，用T4 DNA連接酶將其骨架與兩端帶有BglⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA片段于16 ℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆，接種于2 mL含100 mg/L Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)10 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將構(gòu)建正確的轉(zhuǎn)座子載體命名為JMB405-3TR-5TR。

1.3 報(bào)告載體JMB84-Rosa26BS-Ura 的構(gòu)建

Rosa26BS為鋅指蛋白(ZFP)特異性識(shí)別位點(diǎn)，其堿基序列為：5′-GCAACTCCAGTCTTTCTTGGGCGGGAGTC-3′，根據(jù)該序列利用primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)包含Rosa26BS鋅指蛋白特異性識(shí)別位點(diǎn)的上游引物JMB84-F1、JMB84-F2和下游引物JMB84-R，JMB84-F1序列為：5′-GCAACTCCAGT-CTTTCTTGGGCGGGAGTCATGTCGAAAGCT-ACATATAAG-3′，JMB84-F2序列為：5′-AACCT-GCAGGAAACGAAGATAAATCATGTGCAAC-TCCAGTCTTTCTTGG-3′，JMB84-R序列為：5′- AGTGGATCCGAATTCGATATCAAGCTTATC-3′，JMB84-F2和JMB84-R序列中的下劃線(xiàn)部分分別為PstⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。通過(guò)2步PCR擴(kuò)增Rosa26BS位點(diǎn)，以JMB84-Ura為模板，JMB84-F1、JMB84-R為引物進(jìn)行第1步PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：模板2.0 μL，引物各0.5 μL，dNTPs 4.0 μL，10× Buffer 5.0 μL，easyTaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃反應(yīng)30 s，68 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)2 min，16個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度減低1 ℃；94 ℃反應(yīng)30 s，52 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)2 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。再以第1步PCR產(chǎn)物為模板，JMB84-F2、JMB84-R為引物進(jìn)行第2步PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序同第1步PCR。分別將第2步PCR產(chǎn)物和JMB84-Ura載體用PstⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切并連接、轉(zhuǎn)化得到JMB84-Rosa26BS-Ura報(bào)告載體，使用PstⅠ和BamHⅠ雙酶切JMB84-Rosa26BS-Ura報(bào)告載體對(duì)其進(jìn)行鑒定，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4 JMB440-ZFP-trans 轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)的構(gòu)建

1.4.1 JMB440-ZFP載體的構(gòu)建 于37 ℃下用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切Pst1374-ZFP和JMB440載體，酶切時(shí)間3 h，將得到的ZFP序列連接到骨架載體JMB440中，獲得JMB440-ZFP載體，使用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切JMB440-ZFP載體進(jìn)行鑒定, 酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4.2 易錯(cuò)PCR方法對(duì)突變轉(zhuǎn)座酶的擴(kuò)增 為增加轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)的多樣性，通過(guò)改變PCR反應(yīng)體系中Mg2+、Mn2+和dNTPs的濃度，使用易錯(cuò)PCR方法隨機(jī)突變野生型PiggyBac轉(zhuǎn)座酶基因序列，以期獲得有活性的高效轉(zhuǎn)座酶。根據(jù)野生型PiggyBac轉(zhuǎn)座酶基因序列，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物PB-transF和PB-transR，PB-transF序列為：5′-GGTGGATCCATGGGTAGTTCTTTAG-3′，PB-transR序列為：5′-GCGCTCGAGGTCAGAAACAACTTTGGCAC-3′，引物PB-transF和 PB-transR下劃線(xiàn)部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系如表1所示，PCR反應(yīng)程序同1.2。用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系的組成Table 1 Composition of error-prone PCR reaction system μL

注：A、B、C和D 4組中dATP、dTTP、dGTP和dCTP的體積分別為4,1,2,3;3,4,1,2;2,3,4,1;1,2,3,4 μL。

Note:The volumes of dATP,dTTP,dGTP and dCTP in A,B,C and D respectively are 4,1,2,3;3,4,1,2;2,3,4,1;1,2,3,4 μL,respectively.

用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)14個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，回收能夠擴(kuò)增出目的條帶的PCR產(chǎn)物，用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ對(duì)膠回收后的PCR產(chǎn)物和JMB440-ZFP載體進(jìn)行雙酶切。根據(jù)PCR產(chǎn)物(trans)和JMB440-ZFP的濃度，設(shè)計(jì)不同的連接體系(表2)，通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化方法尋找最佳連接體系后(轉(zhuǎn)化后對(duì)照組培養(yǎng)板中沒(méi)有單克隆菌落或較少，而試驗(yàn)組培養(yǎng)板中單克隆菌落較多的連接體系為最佳連接體系)，依據(jù)最佳連接體系進(jìn)行大量連接。

表2 基于化學(xué)轉(zhuǎn)化方法尋找最佳連接體系的組成Table 2 Best ligation system composition by chemical transformation μL

1.4.3 連接產(chǎn)物的純化 采用核酸共沉淀法純化連接產(chǎn)物，去除鹽離子，純化方法如下：取200 μL連接產(chǎn)物，于65 ℃下滅活20 min；向連接體系中加4 μL DNAmate、1/10體積(20 μL)的CH3COONa和2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇；4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；加500 μL 預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇漂洗2遍，12 000 r/min 離心5 min；干燥，加入30 μL去離子水溶解。

1.4.4 純化連接產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化及突變庫(kù)的獲得 將純化的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中(電轉(zhuǎn)化參數(shù)為2 500 V，200 Ω，25 μF(Bio-Rad Gene Pulser))，將電轉(zhuǎn)化菌液涂布于含Amp (100 mg/L)的LB平板上，于次日將平板上長(zhǎng)出的全部單克隆用含Amp (100 mg/L)的LB培養(yǎng)液沖洗干凈，150 r/min、37 ℃搖菌4 h，提取質(zhì)粒，得到JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)，使用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5 酵母轉(zhuǎn)化與高效轉(zhuǎn)座酶的篩選

1.5.1 酵母轉(zhuǎn)化 根據(jù)Gietz等[18]報(bào)道的LiAc酵母轉(zhuǎn)化方法，將JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)(帶Leu標(biāo)簽)、JMB405-3TR-5TR(帶Trp標(biāo)簽)和JMB84-Rosa26BS-Ura(帶Ura標(biāo)簽)以不同組合方式轉(zhuǎn)化到釀酒酵母JMY1中，利用Ura-5FOA酵母篩選系統(tǒng)[19-20]進(jìn)行轉(zhuǎn)座酶篩選。

1.5.2 高效轉(zhuǎn)座酶的篩選 由于Rosa26BS序列位于Ura基因上游，ZFP蛋白可以特異性地識(shí)別并結(jié)合在此位置，當(dāng)ZFP與Rosa26BS序列結(jié)合后，與ZFP融合表達(dá)的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的切割范圍被限定于Rosa26BS位點(diǎn)附近的TTAA位點(diǎn)處。當(dāng)PiggyBac轉(zhuǎn)座子插入并阻斷Ura基因的表達(dá)，Ura基因不表達(dá)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生酶促反應(yīng)，在含有0.5 mg/mL 5FOA培養(yǎng)基中不會(huì)發(fā)生毒性反應(yīng)，酵母可以生長(zhǎng)。當(dāng)PiggyBac轉(zhuǎn)座子未特異性地插入U(xiǎn)ra基因序列中的TTAA位點(diǎn)時(shí)，Ura基因不會(huì)被阻斷而表達(dá)，則會(huì)發(fā)生酶促反應(yīng)，在含有0.5 mg/mL 5FOA培養(yǎng)基中會(huì)發(fā)生毒性反應(yīng)，導(dǎo)致酵母死亡。

(1)第1次篩選。將JMB84-Rosa26BS-Ura載體作為陽(yáng)性對(duì)照組，JMB84-Rosa26BS-Ura/JMB405-3TR-5TR作為陰性對(duì)照組，JMB84-Ro-sa26BS-Ura/JMB405-3TR-5TR/JMB440-ZFP-trans作為試驗(yàn)組，分別在含不同質(zhì)量濃度(0,0.2,0.5,0.7 mg/mL) 5FOA培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。篩選體系如表3所示。

表3 高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的第1次篩選體系Table 3 First round screening of hyperactive PiggyBac transposases

(2)第2次篩選。 根據(jù)第1次篩選結(jié)果，從篩選平板1-10、1-11中分別挑取10個(gè)克隆，分別標(biāo)記為10-1～10-10和11-1～11-10，在SD(-Leu-Trp-Ura)酵母培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=1，使用Omega公司酵母提取試劑盒提取酵母質(zhì)粒。將提取的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含Amp (100 mg/L)抗性的LB固體平板上篩選。每個(gè)平板挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切篩選JMB440-ZFP-trans載體，獲得19個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒(10-3-5、11-8-6、10-1-8、10-2-7、10-4-3、10-5-6、10-6-5、10-7-7、10-8-2、10-9-2、10-10-8、11-1-8、11-2-1、11-3-5、11-10-4、11-5-1、11-6-4、11-7-8、11-9-2)。

分別將第1輪篩選出的19個(gè)JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶載體與JMB405-3TR-5TR和JMB84-Rosa26BS-Ura共同轉(zhuǎn)化到釀酒酵母JMY1中，在含 0.5 mg/mL 5FOA的培養(yǎng)基中篩選，轉(zhuǎn)化組合如表4所示。

表4 高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的第2次篩選體系Table 4 Second round screening of hyperactive PiggyBac transposases

續(xù)表4 Continued table 4

(3)第3次篩選。根據(jù)第2次篩選結(jié)果，將篩選出最高效的11個(gè)JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶載體(10-3-5、11-8-6、10-1-8、10-9-2、11-1-8、11-2-1、11-3-5、11-10-4、11-6-4、11-7-8和11-9-2)和JMB440-ZFP-WTtrans野生型轉(zhuǎn)座酶載體進(jìn)行第3次篩選，試驗(yàn)條件同第2次篩選。試驗(yàn)同時(shí)將JMB440-ZFP-WTtrans野生型轉(zhuǎn)座酶載體作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)座子載體JMB405-3TR-5TR的鑒定

將構(gòu)建的JMB405-3TR-5TR載體用XhoⅠ和SmaⅠ(該酶切位點(diǎn)位于JMB405載體上的BamHⅠ酶切位點(diǎn)之后)進(jìn)行雙酶切，結(jié)果獲得了578 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明JMB405-3TR-5TR載體構(gòu)建成功。

2.2 報(bào)告載體JMB84-Rosa26BS-Ura 的鑒定

用PstⅠ和BamHⅠ雙酶切報(bào)告載體JMB84-Rosa26BS-Ura，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，獲得長(zhǎng)度為 1 850 bp的條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致，表明報(bào)告載體JMB84-Rosa26BS-Ura構(gòu)建成功。

圖1 轉(zhuǎn)座子載體JMB405-3TR-5TR的XhoⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定M.2 000 Plus DNA Marker;1～3.酶切產(chǎn)物Fig.1 Double digestion of the recombinant vector JMB405-3TR-5TR with XhoⅠ and SmaⅠ M.2 000 Plus DNA Marker；1-3.Double digestion products

2.3 JMB440-ZFP-trans 轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)的構(gòu)建

2.3.1 JMB440-ZFP載體的鑒定 將構(gòu)建的JMB440-ZFP用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切，結(jié)果獲得了548 bp的條帶(圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明JMB440-ZFP載體構(gòu)建成功。

圖3 載體JMB440-ZFP的XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定M.2 000 Plus DNA Marker；1.雙酶切產(chǎn)物Fig.3 Double digestion of JMB440-ZFP with XbaⅠ and BamHⅠM.2 000 Plus DNA Marker；1. Double digestion products

2.3.2 易錯(cuò)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè) 由圖4可知，在體系 1～6 和10～14中獲得了1 700 bp的片段，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致；而體系7～9中無(wú)PCR產(chǎn)物，其原因是體系中Mn2+濃度太高，導(dǎo)致PCR反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。

2.3.3 JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)的鑒定 根據(jù)1.4.2中尋找的最佳連接體系2進(jìn)行大量連接，構(gòu)建得到的JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)，用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，結(jié)果獲得了1 792 bp的條帶(圖5)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)構(gòu)建成功。

2.4 高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的篩選

2.4.1 第1次篩選 由圖6可知，陽(yáng)性對(duì)照組中1-1號(hào)培養(yǎng)板上有單克隆菌落生長(zhǎng)；而1-2和1-3號(hào)培養(yǎng)板上沒(méi)有單克隆菌落生長(zhǎng)，表明當(dāng)5FOA質(zhì)量濃度為0.2～0.5 mg/mL 時(shí)，Ura基因的表達(dá)殺死了酵母。陰性對(duì)照中1-4號(hào)培養(yǎng)板上有單克隆菌落存活，而1-5～1-7號(hào)培養(yǎng)板上無(wú)單克隆菌落存活，表明在僅含有轉(zhuǎn)座子載體時(shí)無(wú)法完成轉(zhuǎn)座，則轉(zhuǎn)座子不能阻斷Ura基因的表達(dá)，從而在5FOA質(zhì)量濃度僅為0.2 mg/mL的培養(yǎng)板上Ura基因表達(dá)時(shí)即可殺死酵母。試驗(yàn)組培養(yǎng)板上均有單克隆菌落生長(zhǎng)，表明在含有轉(zhuǎn)座酶載體存在時(shí)，轉(zhuǎn)座子成功阻斷了Ura基因的表達(dá)，導(dǎo)致5FOA質(zhì)量濃度為0.2～0.7 mg/mL時(shí)酵母仍可生長(zhǎng)。酵母存活數(shù)量越多，表明轉(zhuǎn)座酶將轉(zhuǎn)座子成功轉(zhuǎn)座到Ura基因序列的效率越高。

圖4 易錯(cuò)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)
M.15 000 DNA Marker；1～14分別為表1中1～14號(hào)體系的易錯(cuò)PCR反應(yīng)產(chǎn)物
Fig.4 Detection of error-prone PCR product
M.15 000 DNA Marker；1-14.Error-prone PCR products have the same numbers of 1-14 as Table 1

2.4.2 第2次篩選 由圖7-A可知， 2-1、2-2、2-3、2-10、2-12、2-13、2-14、2-15、2-17、2-18和2-19號(hào)試驗(yàn)培養(yǎng)板中酵母菌落長(zhǎng)勢(shì)較好，表明這11組對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶載體(10-3-5、11-8-6、10-1-8、10-9-2、11-1-8、11-2-1、11-3-5、11-10-4、11-6-4、11-7-8和11-9-2)成功地將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到Ura基因中，并阻斷了Ura基因的表達(dá)；2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-11和2-16號(hào)培養(yǎng)板中酵母長(zhǎng)勢(shì)較差，表明其對(duì)應(yīng)試驗(yàn)中的報(bào)告載體(10-2-7、10-4-3、10-5-6、10-6-5、10-7-7、10-8-2、10-10-8和11-5-1)沒(méi)有或者僅有少量的Ura基因被阻斷表達(dá)，轉(zhuǎn)座酶活性較弱。

2.4.3 第3次篩選 由圖7-B可知，10-9-2、11-1-8、11-10-4、11-7-8和11-9-2號(hào)培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)的單克隆菌落長(zhǎng)勢(shì)較好，表明其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶具有較高的轉(zhuǎn)座活性，阻斷了Ura基因的表達(dá)。野生型對(duì)照組(WT)沒(méi)有單克隆菌落生長(zhǎng)，表明野生型轉(zhuǎn)座酶在5FOA質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)沒(méi)有阻斷Ura基因的表達(dá)。10-3-5、11-8-6、10-1-8、11-2-1、11-3-5和11-6-4號(hào)培養(yǎng)板中的酵母菌落長(zhǎng)勢(shì)較差，表明其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶在轉(zhuǎn)座過(guò)程中阻斷Ura基因表達(dá)的效率較野生型轉(zhuǎn)座酶(WT)效率高，但較10-9-2、11-1-8、11-10-4、11-7-8和11-9-2號(hào)培養(yǎng)板中的轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座效率低。因此，經(jīng)過(guò)3次0.5 mg/mL 5FOA篩選得到的10-9-2、11-1-8、11-10-4、11-7-8和11-9-2號(hào)培養(yǎng)板中5個(gè)轉(zhuǎn)座酶即為高效轉(zhuǎn)座酶。

圖5 JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)的XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定M.2 000 Plus DNA Marker；1.轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)的雙切酶切產(chǎn)物Fig.5 Double digestion of JMB440-ZFP-trans library with XhoⅠ and BamHⅠ M.2 000 Plus DNA Marker；1.Double digestion products

圖6 高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的第1次篩選1-1～1-11與表3中的試驗(yàn)序號(hào)一致；1-1～1-3為陽(yáng)性對(duì)照組；1-4～1-7為陰性對(duì)照組；1-8～1-11為試驗(yàn)組Fig.6 First round screening of hyperactive PiggyBac transposases 1-1-1-11 are consistent with Table 3;1-1-1-3 are positive controls;1-4-1-7 are negative controls;1-8-1-11 are experimental groups

圖7 高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的第2次(A)和第3次(B)篩選2-1～2-19與表4中的試驗(yàn)序號(hào)一致;10-3-5、11-8-6、10-1-8、10-9-2、11-1-8、11-2-1、11-3-5、11-10-4、11-6-4、11-7-8和11-9-2為載體編號(hào)；WT為JMB440-ZFP-WTtrans野生型轉(zhuǎn)座酶載體Fig.7 Second round (A) and the third round (B) screening of hyperactive PiggyBac transposases 2-1-2-19 are consistent with Table 4;10-3-5,11-8-6,10-1-8,10-9-2,11-1-8,11-2-1,11-3-5,11-10-4,11-6-4,11-7-8 and 11-9-2 are the numbers of vectors;WT represents JMB440-ZFP-WTtrans wild type transposeses vector

3 討 論

PiggyBac轉(zhuǎn)座子屬于離解型轉(zhuǎn)座子，該轉(zhuǎn)座子本身不能編碼自己的轉(zhuǎn)座酶，PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)座酶載體和轉(zhuǎn)座子供體載體。轉(zhuǎn)座子供體載體在轉(zhuǎn)座酶載體協(xié)助下可攜帶外源基因在基因組中進(jìn)行插入和轉(zhuǎn)座，其轉(zhuǎn)座效率依賴(lài)于轉(zhuǎn)座酶的切割效率。因此，通過(guò)對(duì)PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中轉(zhuǎn)座酶切割效率的優(yōu)化，可以作為提高該系統(tǒng)轉(zhuǎn)座效率的突破點(diǎn)。本研究通過(guò)易錯(cuò)PCR方法隨機(jī)突變轉(zhuǎn)座酶基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)座酶突變庫(kù)，獲得高效的突變轉(zhuǎn)座酶。為了提高轉(zhuǎn)座子的定點(diǎn)識(shí)別能力，有效地克服其隨機(jī)轉(zhuǎn)座不易控制的缺點(diǎn)，本試驗(yàn)將突變的高效轉(zhuǎn)座酶與ZFP具有靶向特異性識(shí)別的位點(diǎn)Rosa26BS融合表達(dá)，構(gòu)建JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)。

本研究將JMB405-3TR-5TR轉(zhuǎn)座子載體、JMB84-Rosa26BS-Ura報(bào)告載體、JMB440-ZFP-trans轉(zhuǎn)座酶載體突變庫(kù)共轉(zhuǎn)化到釀酒酵母JMY1中，通過(guò)Ura-5FOA系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)座酶篩選。將ZFP與具有特異性轉(zhuǎn)座能力的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行融合表達(dá)，具有位點(diǎn)特異性識(shí)別功能的ZFP靶向結(jié)合于Ura基因上游的Rosa26BS位點(diǎn)處，從而有效地控制了PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的切割范圍?；谌诤媳磉_(dá)蛋白ZFP的限制，PiggyBac轉(zhuǎn)座酶只切割ZFP識(shí)別位點(diǎn)Rosa26BS序列附近的TTAA位點(diǎn)，并阻斷Ura基因的表達(dá)。Ura基因不表達(dá)，釀酒酵母JMY1可以在含有5FOA篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)3輪有效篩選，筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)突變后的轉(zhuǎn)座酶較野生型轉(zhuǎn)座酶表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)座效率，并最終獲得5個(gè)高效的能夠定點(diǎn)轉(zhuǎn)座的ZFP-PiggyBac轉(zhuǎn)座酶。

高效ZFP-PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的建立可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因位點(diǎn)附近基因的定點(diǎn)敲除或者目的基因的定點(diǎn)引入。將篩選出的高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)與根據(jù)特殊目的設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)座子載體配合，形成高效的PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，進(jìn)一步提高外源基因在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的整合效率，且能實(shí)現(xiàn)基因的可控切離，提高了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中的安全性。將高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶與特異性識(shí)別DNA序列的鋅指蛋白(ZFP)融合，構(gòu)建ZFP-PiggyBac轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)，在ZFP識(shí)別位點(diǎn)附近的TTAA處實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)插入目的基因。通過(guò)與不同的ZFP進(jìn)行融合，可以根據(jù)科研工作者的不同需求獲得多種ZFP-PiggyBac轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)，使得在動(dòng)物基因組中感興趣的位點(diǎn)插入目的基因成為可能。

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Construction and screening of hyperactive PiggyBac transposases

ZHANG Longa,LIANG Ming-fub,ZHANG Zhi-yinga

(aCollegeofAnimalScienceandTechnology,bCollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to construct highly efficient and site-directed PiggyBac transposase system.【Method】 Wild-type PiggyBac transposase was used as template to construct mutant transposase library with random mutation transposase gene by error-prone PCR.Fusion expression with the ZFP protein that can recognize and bind the target DNA sequence was conducted to get ZFP-PiggyBac mutant transposase library system.Then the mutant transposase library,transposon and report vector were co-transformed into Saccharomyces cerevisiae JMY1.Highly efficient and site-specific transposases were screened by Ura-5FOA yeast screening system.【Result】 Highly efficient ZFP-PiggyBac mutant transposase library was successfully constructed.After three times of screening,five hyperactively mutant transposases were obtained.【Conclusion】 Newly constructed ZFP-PiggyBac mutant transposase library had the site-specific and efficient transposable ability at the ZFP protein recognition domain Rosa 26BS.

5FOA;transposase;zinc finger protein

2014-01-21

農(nóng)業(yè)部“948”計(jì)劃項(xiàng)目“高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶引進(jìn)及改造”(2013-Z17)

張 龍(1988-)，男，安徽淮北人，碩士，主要從事轉(zhuǎn)基因操作研究。E-mail：zhlong990@hotmail.com

張智英(1958-)，男，陜西興平人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物基因組學(xué)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)研究。 E-mail：zhangzhy@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.008

Q78

A

1671-9387(2015)08-0001-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.008.html