王少毅，周曉聰

河北大學臨床醫(yī)學院

SD大鼠體外神經元培養(yǎng)技術的簡介

王少毅，周曉聰

河北大學臨床醫(yī)學院

目的：尋求一種簡單、廉價的原代SD大鼠神經元原代培養(yǎng)方法。方法：采用胰蛋白酶消化法制備游離神經細胞懸液,進行培養(yǎng)。結果：通過多次探索、觀察、成功的進行了原代神經元原代培養(yǎng)。結論：本方法適合一般實驗室開展SD新生大鼠神經元細胞的培養(yǎng)。

1、材料和方法

1.1 材料

新生SD大鼠（24h以內）；含10%FBS（胚牛血清）的DMEM培養(yǎng)液：0.25%胰蛋白酶；L-多聚賴氨酸；含2%B27（含青鏈霉素）的neurolbasal培養(yǎng)液；阿糖胞苷濃度為10uM的neurolbasal培養(yǎng)液；75%酒精；D-PBS平衡液；無菌操作器械一套（中號鑷子、大剪刀、一把眼科剪、一把小彎鑷子、兩把小鑷子、一把止血鉗）、十只5ml離心管、2只50ml離心管、8板細胞培養(yǎng)板（每板6孔）、12塊蓋玻片、圓形小培養(yǎng)皿、胰蛋白酶濾器、200目細胞濾器、2只5ml注射器、一只移液管、2把移液槍（一把200ul的，另一把1000ul）、污物缸、小燒杯、無菌工作臺、水浴箱、細胞培養(yǎng)箱、細胞計數(shù)板、光學顯微鏡、泡沫浮板、冰袋。

1.2 神經元細胞的原代培養(yǎng)方法

1.2.1 取材

取新生24h內的SD大鼠（10只），酒精消毒后，斷頭處死，在超級工作臺中中暴露大腦，剝離腦膜，去除血管，取下0.5mm×1mm× 2mm的大腦皮質組織，置入冰袋上裝有DMEM的小培養(yǎng)皿蓋中，用小彎鑷輕柔搗碎組織，成粥狀。

1.2.2 細胞分離與培養(yǎng)

將搗碎的組織放入準備好的胰酶消化管中（10管，每管中約5ml胰酶），蓋上蓋子，37℃溫水浴15分鐘（每5分鐘翻轉一次），使之成云霧狀。用一次性無菌塑料吸管吸出消化的組織，放入15mlDMEM培養(yǎng)液中，終止消化，然后用另一支無菌塑料吸管輕柔吹打細胞，大約20次。用5ml注射器吸出組織，經帶有篩網的無菌濾器，注入無菌的離心管中，待用。用200ul的移液槍，取一滴細胞，置于細胞計數(shù)板上，計數(shù)細胞。

1.2.3 接種細胞與細胞純化

將細胞懸液按每孔1-3毫升移入細胞培養(yǎng)板中，以大約每孔（120-150）×104個細胞的密度種細胞。接種細胞后12h更換培養(yǎng)液，neurolbasal+B27（含青鏈霉素）培養(yǎng)液1毫升。之后于接種細胞后24h加入含阿糖胞苷的neurolbasal培養(yǎng)液1ml。加入阿糖胞苷后，每48h用neurolbasal+B27（含青鏈霉素）的培養(yǎng)液半量更換培養(yǎng)基。

1.3 、形態(tài)學觀察

與每天固定時間，將培養(yǎng)的神經元置于倒置的顯微鏡下進行觀察，注意神經元的生長狀況。

1.4 、MTT法測定細胞的存活率

以MTT法測定細胞的存活率,細胞的存活率以正常對照組OD值均數(shù)為100%,用公式進行計算：細胞存活率(%)=各孔OD值/正常OD值均數(shù)×100。

1.5 、免疫細胞化學鑒定

1.5.1 、取片

神經元培養(yǎng)10d后，棄去培養(yǎng)液，冷4%甲醛1ml固定15min，之后用PBS平衡鹽溶液沖洗3遍，取出玻片，晾干后，-20度冷凍備用。

1.5.2 、神經元免疫化學染色步驟

將冷凍的玻片取出，用樹膠粘于較大的載玻片上，置于3-8度冷藏15min。之后PBS平衡鹽溶液浸泡10min。浸泡完后用PBS液沖洗3遍，吸水紙擦干水份。TritonX-100，加入目標區(qū)域，用于提取膜蛋白，驅除非離子性污垢。37℃潮濕環(huán)境下，靜置15min。PBS液沖洗玻片，再在PBS液中浸泡5min，吸水紙吸干水分。向目標區(qū)域加入兔抗鼠的NSE多克隆抗體（一抗，1：100）。37℃，潮濕環(huán)境下，靜置1h。PBS沖洗兩遍，浸泡1min，加入人抗兔NSE多克隆抗體（二抗）。37攝氏度，潮濕環(huán)境下靜置20min。用PBS沖洗，加入抗二抗，37℃，潮濕環(huán)境下，靜置30min。PBS沖洗，向目標區(qū)域加入DAB顯色劑，靜置1min后，清水沖洗。HE染色。中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。

2、結果與分析

2.1 培養(yǎng)神經元的一般觀察及鑒定

神經元細胞接剛接種于培養(yǎng)基上時，體積小，透亮，單個均勻分布，未見突起，半懸浮于培養(yǎng)液中。接種6h后有少量細胞開始貼壁,剛貼壁的細胞呈圓形、胞體亮部分呈出芽狀;培養(yǎng)24h各孔細胞完成貼壁且大部分細胞伸出三四個突起,長度為10～30μm不等,最長者可達50μm以上,其中有些細胞發(fā)生再聚合現(xiàn)象;培養(yǎng)至3d時,神經元突起進一步增多并延長,形成稀疏的網絡,培養(yǎng)的神經元細胞以多個突起的錐體細胞為主,胞體呈三角形或橢圓形,體積較大,長徑約為8～12μm。其中也有部分2個突起的雙極神經元,胞體呈橢圓形,長徑為6～8μm。胞體亮、透光性強,周邊有光暈,胞漿豐富,核大,核仁隱約可見,突起明顯增長。培養(yǎng)至10d時，可見神經元其胞體較非神經元胞體小呈錐體形、卵圓形或梭形,胞體周圍光暈明顯;核呈圓形較亮,核仁清晰可見;突起細長,有的相互交織成網。而培養(yǎng)的非神經元細胞胞體較大,多呈條帶狀,突起較粗。神經元位于培養(yǎng)細胞的表層,而非神經元大都位于培養(yǎng)細胞的深層。

2.2 抗有絲分裂劑阿糖胞苷對神經元純度的影響

加入阿糖胞苷作用24 h,雖使神經元存活率一度降低,但其抑制膠質細胞增殖的作用非常明顯。加入阿糖胞苷可使神經元純度得到明顯的提高,提高度可達10%到20%左右。

2.3 鑒定

神經元特異標記NSE免疫熒光檢測陽性。

3、結論

采用0.25%胰蛋白酶消化進行培養(yǎng)神經元的分離,以neurolbasal培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基質，并在培養(yǎng)第1d，加入神經膠質細胞抑制劑阿糖胞苷，于培養(yǎng)10d后可以收獲細胞存活率35%，神經元純度85%的神經元細胞。希望此方法可以為進行有關神經系統(tǒng)相關問題研究的學者，提供幫助。