張鶴

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司

蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

張鶴

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司

心腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，溶栓劑的研究與開發(fā)具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。溶栓劑來(lái)源廣泛，其中微生物來(lái)源的溶栓劑展現(xiàn)出誘人的前景。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)20種大型真菌進(jìn)行篩查，研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草深層培養(yǎng)發(fā)酵液中具有纖溶活性物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)蛹蟲草纖溶酶中有兩個(gè)活性組分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛹蟲草纖溶酶第三活性組分相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。由SDS-PAGE測(cè)定蛹蟲草纖溶酶由單個(gè)亞基組成相對(duì)分子量約為28000Da；蛹蟲草纖溶酶具有直接纖溶活性，對(duì)纖溶酶原的激活作用不明顯。

蛹蟲草；纖溶酶；酶學(xué)性質(zhì)

1.實(shí)驗(yàn)材料

蛹蟲草纖溶酶（經(jīng)純化后獲得的第三組分）、透析袋、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、β-巰基乙醇、瓊脂糖、考馬斯亮蘭R-250、溴酚蘭、凝血酶、牛血纖維蛋白原、α-萘酚、胃蛋白酶。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1.SDS-PAGE法測(cè)定蛹蟲草纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量

①樣品處理方法：精提純后的酶液經(jīng)透析除鹽，再將其濃度濃縮至2mg/mL，取15μl樣品，加入等體積變性樣品溶解液，電泳前煮沸3～5min。

②選擇凝膠濃度為12%（w/v）的分離膠，5%（w/v）的濃縮膠，交聯(lián)度為2.6%，灌注于雙垂直板電泳模具中。

③電泳方法：上樣后，先恒電壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠后恒電壓120V，當(dāng)含有溴酚藍(lán)指示劑的前沿到達(dá)凝膠底部時(shí)結(jié)束電泳，大約要3～4h。

④固定、染色和脫色：電泳完畢后，小心取出凝膠，在15%(w/v)三氯乙酸固定液中固定過(guò)夜，再用考馬斯亮蘭R250染色液染色4h，然后用脫色液脫色，直至背景清晰無(wú)色。最后用凝膠成像系統(tǒng)分析測(cè)定目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子量。

2.2.蟲草纖溶酶對(duì)纖溶酶原的激活作用

市售的纖維蛋白原大都混有纖溶酶原，如果將配制好的血纖維平板在85℃下保溫30min，則可以使纖溶酶原失活，經(jīng)過(guò)這樣處理的平板稱為陰性平板，在此平板上形成溶圈顯示的是纖溶酶的直接纖溶活性，不經(jīng)過(guò)此處理的平板稱為陽(yáng)性平板。通過(guò)對(duì)比陰陽(yáng)性平板上透明溶圈的大小可以檢驗(yàn)纖溶酶是否具有激活纖溶酶原的活性。測(cè)定時(shí)，分別點(diǎn)同一酶樣10μL于陽(yáng)性和陰性平板上，平行點(diǎn)五次，然后比較蛹蟲草纖溶酶在陽(yáng)性和陰性平板上的活性差異，若兩者相差較大，即表明此蛹蟲草纖溶酶有激酶活性，若兩者差異較小，即此蛹蟲草纖溶酶的纖溶酶原激酶活性不明顯。

2.3.蟲草纖溶酶對(duì)人血纖維蛋白原的降解情況

將2%人血纖維蛋白原23μL與23μL 0.01mg/mL的酶液混勻置于離心管中于37℃分別保溫30S、1min、5min、10min、2h、4h、6h、 8h、12h，定時(shí)快速取出加入10μL等體積樣品溶解液，沸水浴終止酶促反應(yīng)。將保溫不同時(shí)間的反應(yīng)液進(jìn)行SDS-PAGE垂直板電泳，電泳時(shí)加入還原的人血纖維蛋原作對(duì)照，通過(guò)觀察α、β和γ鏈的含量變化確定該纖溶酶對(duì)人血纖維蛋白原各亞基的降解情況。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.SDS-PAGE法測(cè)定蛹蟲草纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量

本實(shí)驗(yàn)選擇交聯(lián)度為2.6%，凝膠濃度為12%，選用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量范圍是14,400～97,400Da。

用SDS-PAGE測(cè)定經(jīng)分離純化后的蛹蟲草纖溶酶純酶樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。經(jīng)電泳檢測(cè)并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)的Labworks軟件分析出該亞基相對(duì)分子質(zhì)量約為28000Da。

3.2.蟲草纖溶酶對(duì)纖溶酶原的激活作用

用加熱血纖維蛋白平板法測(cè)定蛹蟲草纖溶酶對(duì)人纖溶酶原是否有激活作用，比較陽(yáng)性和陰性平板上的活性差異，若陽(yáng)性平板的溶圈明顯比陰性平板的大，即表明此蛹蟲草纖溶酶有纖溶酶原激酶活性，若兩者無(wú)明顯差異，即此蛹蟲草纖溶酶的纖溶酶原激酶活性不明顯。

通過(guò)對(duì)平板的觀察，蛹蟲草纖溶酶在陰性平板上的溶圈直徑比陽(yáng)性平板的溶圈直徑小，因此可以判斷此蛹蟲草纖溶酶不但可以直接降解血纖維蛋白，而且具有激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶共同參與溶栓的作用。

3.3.蟲草纖溶酶對(duì)人血纖維蛋白原的降解情況

本實(shí)驗(yàn)用SDS-PAGE檢測(cè)蛹蟲草纖溶酶對(duì)人血纖維蛋白原的降解規(guī)律，分離膠濃度選擇12%，降解圖譜如圖2-9，30S后α鏈就開始降解，1min后α鏈和β鏈都完全降解，2h后γ鏈降解完畢，這一降解順序與人纖溶酶降解纖維蛋白原各亞基的情況是一樣的。

4.結(jié)論

本文以蛹蟲草為菌種液體發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶，對(duì)純化后的纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)做了研究。得出以下結(jié)論：①蛹蟲草纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)此蛹蟲草纖溶酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為28000Da。②Aprotinine和SBTI對(duì)此蛹蟲草纖溶酶的活性有明顯抑制作用，由此可以判斷出這種新型纖溶酶可能是絲氨酸蛋白酶。③該酶可以順次降解人血纖維蛋白的α、β和γ三個(gè)亞基。該酶不但可以直接降解血纖維蛋白，而且具有激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶共同參與溶栓的作用。

[1]祁輝，余蓉，李曉紅等.一株誘變枯草桿菌溶栓酶性質(zhì)研究的初探.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2003，19(1)：5-7

[2]吳冠蕓，潘華珍，吳翠.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用數(shù)據(jù)手冊(cè)（第一版）.科學(xué)出版社，1999

[3]李建武，蕭能賡，余瑞元，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法（第一版）.北京：北京大學(xué)出版社，2002，168～170