喬 健,孫美珍,賈梅娟

左乙拉西坦在外傷性癲癇中神經(jīng)保護的實驗研究

喬 健1,孫美珍2,賈梅娟2

目的觀察左乙拉西坦急性期干預(yù)對大鼠外傷性癲癇的行為學(xué)、海馬神經(jīng)細胞凋亡與膠質(zhì)細胞增生的影響。方法三氯化鐵皮層注射造模后,予以左乙拉西坦灌胃干預(yù),將大鼠隨機分為健康對照組、模型組及左乙拉西坦75 mg/kg劑量預(yù)防組(低劑量組)、150 mg/kg劑量預(yù)防組(中劑量組)、300 mg/kg劑量預(yù)防組(高劑量組)、600 mg/kg劑量預(yù)防組(極高劑量組)。觀察各組大鼠造模7 d后的癲癇行為學(xué)改變;采用Fluoro Jade-C熒光技術(shù)進行海馬CA3區(qū)凋亡神經(jīng)元計數(shù);造模后14 d采用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色觀察海馬CA3區(qū)膠質(zhì)細胞增生。評價左乙拉西坦在大鼠外傷性癲癇急性期的海馬神經(jīng)保護作用。結(jié)果與模型組比較,除低劑量組外,中、高、極高劑量組癲癇發(fā)作次數(shù)、神經(jīng)細胞凋亡與膠質(zhì)細胞增生計數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與低劑量組比較,中、高、極高劑量組癲癇發(fā)作次數(shù)、神經(jīng)細胞凋亡與膠質(zhì)細胞增生計數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論大鼠外傷性癲癇急性期進行左乙拉西坦干預(yù)可以減少癲癇發(fā)作,抑制海馬神經(jīng)元凋亡和膠質(zhì)細胞增生,具有神經(jīng)保護作用。

外傷性癲癇;左乙拉西坦;三氯化鐵;膠質(zhì)細胞增生;神經(jīng)細胞凋亡

腦外傷后,含鐵血黃素外滲沉積于神經(jīng)纖維中,與人類癇性發(fā)作密切相關(guān),三氯化鐵皮層注射可良好地模擬這一致癇機制。左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物,通過與中樞神經(jīng)的突觸囊泡蛋白結(jié)合來調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放發(fā)揮抗癇作用。目前尚無左乙拉西坦在外傷性癲癇(posttraumatic epilepsy,PTE)急性期神經(jīng)保護作用研究的相關(guān)報道。本實驗觀察左乙拉西坦在大鼠外傷性癲癇模型中對癲癇發(fā)作,海馬神經(jīng)元凋亡與膠質(zhì)細胞增生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年SD雄性大鼠48只,清潔級,體重170 g～210 g。由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,標(biāo)準(zhǔn)飼料為喂養(yǎng),自由攝食水,自然光照射,換氣通風(fēng)。

1.2 外傷癲癇模型制備 術(shù)前8 h禁食,以10%水合氯醛0.34 mL/kg腹腔注射,麻醉后固定于立體定位儀。切開頭部皮膚,暴露顱骨于左側(cè)前囟前2 mm,中線旁3 mm,牙鉆鉆孔,微量進樣器抽取三氯化鐵(美國Sigma公司)溶液10μL(5.50 g三氯化鐵溶于200 mL去離子水)進針至硬膜下2.0 mm,5 min緩慢注入皮層,之后停留3 min拔出針芯,觀察無藥物外滲后縫合皮膚。

1.3 實驗動物分組 48只大鼠隨機分為健康對照組、模型控制組、左乙拉西坦低劑量預(yù)防組(低劑量組)、左乙拉西坦中劑量預(yù)防組(中劑量組)、左乙拉西坦高劑量預(yù)防組(高劑量組)、極高劑量預(yù)防組(極高劑量組)6組。健康對照組與模型對照組僅給予生理鹽水灌胃,無藥物干預(yù)。左乙拉西坦低、中、高、極高劑量預(yù)防組在大鼠清醒后分別予以75 mg/kg、150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg左乙拉西坦灌胃干預(yù)7 d,每日1次。

1.4 方法

1.4.1 行為學(xué)觀察 觀察大鼠造模后急性期7 d癲癇發(fā)作行為改變,癇性抽搐發(fā)作程度參照Racine[1]評估標(biāo)準(zhǔn):0級,無驚厥;1級,閉眼、胡須動,口、鼻、面肌陣攣;2級,在1級基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性點頭;3級,在2級基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢陣攣;4級,在3級基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢站立;5級,在4級基礎(chǔ)上出現(xiàn)跌倒發(fā)作。3級及以上發(fā)作為標(biāo)準(zhǔn)。白天觀察,夜間視頻監(jiān)控,次日統(tǒng)計總數(shù)。

1.4.2 病理學(xué)檢測

1.4.2.1 神經(jīng)細胞凋亡檢測 大鼠灌胃7 d后,以10%水合氯醛麻醉,剖胸暴露心臟,經(jīng)左心室灌入生理鹽水60 mL,4%多聚甲醛80 mL斷頭取腦,腦組織置于4%多聚甲醛4℃環(huán)境過夜,之后置于30%蔗糖溶液中沉底,取冠狀位海馬水平切15μm冰凍切片。每只大鼠切5張切片,共6組。

1.4.2.2 Fluoro Jade-C(FJ-C)染色 由美國AAT公司提供,具體步驟:切片室溫復(fù)溫30 min;蒸餾水浸洗2 min;切片浸于含1%NaOH的80%乙醇中5 min; 70%乙醇中浸洗2 min;蒸餾水浸洗2 min;0.06%高錳酸鉀中浸泡10 min;蒸餾水浸洗2 min;0.1%乙酸配制0.000 1%Fluoro Jade-C工作液(染色4 h內(nèi)配制)浸泡反應(yīng)20 min;蒸餾水浸洗3 min;將切片自然晾干,二甲苯透明;抗熒光衰減劑封片;在Olympus53熒光顯微鏡(藍色濾光片)觀察并采集圖像。

1.4.2.3 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組織化學(xué)染色 由武漢博士德公司提供,大鼠灌胃15 d后,經(jīng)剖胸灌注生理鹽水,4%多聚甲醛灌注取腦后石蠟包埋,取冠狀位海馬水平行切片5μm冰凍切片,每組5張,共6組。經(jīng)常規(guī)脫蠟至水,染色步驟逐步進行,中性樹膠封片后光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)改變 本實驗造模成功率為69.6%。大鼠清醒后至第1次癲癇發(fā)作時間為0 h～36 h。急性期癲癇發(fā)作呈現(xiàn)神情呆滯,陣發(fā)性凝視,之后出現(xiàn)自動癥:點頭、哈欠、弓背、后足站立、前肢抽搐和跌倒發(fā)作,持續(xù)時間15 s～40 s。持續(xù)狀態(tài)發(fā)作時意識喪失,全身顫抖,尿失禁,持續(xù)時間2 min～6 min。發(fā)作間期無精打采、結(jié)膜充血、納差進而消瘦,個別大鼠腹部腿毛,毛發(fā)無光澤,稀疏。進入慢性期后,表現(xiàn)為懶動、易激惹,受到刺激時煩躁不安,上躥下跳,撕咬他鼠,可觀察到2級以上的癲癇發(fā)作,時限不超過1 min。予以各劑量左乙拉西坦干預(yù)后,各組大鼠癲癇行為學(xué)均有改善,發(fā)作次數(shù)減少,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。以中、高、極高劑量組效果明顯。詳見表1。

表1 各組急性期大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)比較±s)次

表1 各組急性期大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)比較±s)次

組別n 癲癇發(fā)作健康對照組80模型組824.12±2.17低劑量組823.50±1.77中劑量組812.25±1.491)2)高劑量組8 5.75±1.281)2)極高劑量組8 4.63±1.411)2)與模型組比較,1)P<0.05;與低劑量組比較,2)P<0.05。

2.2 病理學(xué)觀察

2.2.1 神經(jīng)細胞凋亡Fluoro Jade-C是一種陰離子熒光配體染料,可快速、可靠標(biāo)記正發(fā)生變性壞死的腦神經(jīng)元。本實驗結(jié)果顯示,健康對照組同側(cè)海馬CA3區(qū)FJ-C陽性細胞較少,模型組及左乙拉西坦干預(yù)組存在不同程度的FJ-C陽性細胞,提示癲癇發(fā)作后海馬CA3區(qū)發(fā)生了大量神經(jīng)元變性。左乙拉西坦各干預(yù)組和模型組比較,隨左乙拉西坦劑量遞增海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)下降,以中、高、極高劑量組明顯,提示左乙拉西坦可改善癲癇發(fā)作對腦細胞的損傷,具有神經(jīng)保護作用。詳見表2。

2.2.2 膠質(zhì)細胞增生 健康對照組同側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細胞少量增生。模型組海馬CA1區(qū)顯示膠質(zhì)細胞明顯增多,胞體腫脹,密集分布錐體細胞兩側(cè),胞體與樹突染色陽性。左乙拉西坦低、中、高、極高劑量組CA1區(qū)膠質(zhì)細胞增生數(shù)少于模型組,以左乙拉西坦高、極高劑量組明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。詳見表2。

表2 各組神經(jīng)細胞凋亡和膠質(zhì)細胞增生計數(shù)比較±s)

表2 各組神經(jīng)細胞凋亡和膠質(zhì)細胞增生計數(shù)比較±s)

組別n 神經(jīng)細胞凋亡膠質(zhì)細胞增生健康對照組81.80±0.841.60±0.55模型組818.75±1.9118.75±1.83低劑量組816.75±1.6716.88±1.81中劑量組89.38±2.451)2)9.88±1.811)2)高劑量組85.13±2.031)2)5.13±1.641)2)極高劑量組85.88±1.641)2)5.50±1.411)2)與模型組比較,1)P<0.05;與低劑量組比較,2)P<0.05。

3 討 論

皮層注射鐵離子誘發(fā)癲癇可良好地模擬PTE患者的臨床表現(xiàn)和病理研究證實的組織學(xué)改變[2]。癲癇發(fā)作導(dǎo)致海馬神經(jīng)細胞丟失、星形膠質(zhì)細胞增生、海馬齒狀回顆粒細胞突觸重建形成異常興奮通路為晚期癲癇發(fā)生的病理基礎(chǔ)[24]。左乙拉西坦通過作用于中樞神經(jīng)的突觸囊泡蛋白與其結(jié)合來調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而發(fā)揮抗癲癇效用,對γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)遞質(zhì)的抑制作用無促進作用,與興奮性谷氨酸離子型受體無相互作用,在大腦內(nèi)具有特定的膜結(jié)合位點,是作為陽性突觸傳遞的調(diào)制器通過提高囊泡的分泌量來提高釋放的概率[5];是唯一選擇性結(jié)合突觸小泡蛋白SV2A的抗癲癇藥物,調(diào)控囊泡內(nèi)遞質(zhì)釋放,抑制谷氨酸鹽的釋放[6]。左乙拉西坦與SV2A在腦內(nèi)有很高的親和性,與抑制癇性放電密切相關(guān)[7]。既往資料顯示,左乙拉西坦在戊四氮點燃的慢性癲癇模型中無抗抽搐作用[8],目前尚無應(yīng)用左乙拉西坦在急性期外傷性癲癇的模型中對癲癇發(fā)作及相關(guān)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞影響的研究報道。本實驗結(jié)果提示在外傷性癲癇急性期應(yīng)用左乙拉西坦可明顯減少癲癇發(fā)作,顯著減少海馬神經(jīng)元凋亡和抑制膠質(zhì)細胞增生,具有神經(jīng)保護作用。

PTE后頻繁的癇性發(fā)作引起海馬缺血缺氧,隨后的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)前體細胞的增殖分化,或者神經(jīng)膠質(zhì)細胞自身增殖,造成海馬結(jié)構(gòu)紊亂。在本實驗PTE模型中可以見到CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯。每一次癲癇發(fā)作均會使腦組織缺血缺氧,使齒狀回的中間神經(jīng)元因缺氧出現(xiàn)水腫、變性甚至死亡,抑制性中間神經(jīng)元的損傷,使癲癇發(fā)作的結(jié)果變成發(fā)作的原因,形成惡性循環(huán)[9]。以往資料表明,FJ-C可用于檢測大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、黑質(zhì)等神經(jīng)元的變性壞死,標(biāo)記不可逆損害的神經(jīng)元[10,11]。國內(nèi)學(xué)者證實,丙戊酸鈉和左乙拉西坦均對戊四氮慢性致癇大鼠海馬凋亡有抑制作用,是癲癇發(fā)作后對神經(jīng)細胞有保護作用的抗癲癇藥物;左乙拉西坦對戊四氮慢性致癇大鼠海馬細胞凋亡的抑制作用較丙戊酸鈉明顯,提示左乙拉西坦有較好神經(jīng)保護作用[8]。本實驗中模型組海馬神經(jīng)元存在大量陽性FJ-C細胞,表明因癲癇反復(fù)發(fā)作致使神經(jīng)元凋亡,急性期應(yīng)用左乙拉西坦干預(yù)后,不同劑量組均顯示不同程度的FJ-C陽性細胞數(shù)量下降,提示該藥可以減少海馬神經(jīng)元的凋亡,具有神經(jīng)保護作用。

癲癇發(fā)作刺激GFAP表達增多,增生的膠質(zhì)細胞易于凋亡,同時凋亡的膠質(zhì)細胞會進一步損害周圍的正常細胞,加重癲癇病理損害[12],癲癇發(fā)作急性期膠質(zhì)細胞表現(xiàn)為水腫,7 d～14 d增生顯著。磁共振波譜成像研究顯示,伴有海馬硬化的顳葉內(nèi)側(cè)癲癇的同側(cè)頂葉N-乙酰天冬氨酸/(肌酸+膽堿)[NAA/(Cr+ Cho)]降低,這也許是由于神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)增生或神經(jīng)元功能異常引起[13]。林元相[14]采用抗氧化劑干預(yù)外傷性癲癇動物模型,7 d后觀察海馬GFAP陽性表達細胞,結(jié)果表明左乙拉西坦陽性細胞數(shù)較模型組顯著減少但比正常組增多。本實驗中,腦外傷急性期應(yīng)用不同劑量左乙拉西坦干預(yù)后,不同劑量組對膠質(zhì)細胞增生數(shù)量均有抑制作用,說明腦外傷急性期應(yīng)用左乙拉西坦可不同程度干預(yù)神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生。本實驗結(jié)果提示左乙拉西坦能夠預(yù)防外傷性癲癇發(fā)生,減輕與癲癇發(fā)生有關(guān)的海馬神經(jīng)元損害與膠質(zhì)纖維增生,為下一步臨床應(yīng)用左乙拉西坦干預(yù)外傷性癲癇發(fā)生提供可靠的實驗依據(jù)。

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R742.1R259

:A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.022

:1672-1349(2015)02-0195-03

2014-08-08)

(本文編輯郭懷印)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原030001);2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

孫美珍,E-mail:1016545053@qq.com