高效液相色譜法檢測(cè)鴨、鵝可食組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量

楊林　薄永恒　高迎春等

摘要：建立了鴨、鵝組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量檢測(cè)的高效液相色分析方法。試樣中殘留的乙氧酰胺苯甲酯用乙腈提取，濃縮后用正己烷-丙酮溶解殘余物，硅酸鎂固相萃取柱凈化，用甲醇洗脫，收集洗脫液作為試樣溶液供高效液相色譜測(cè)定。該方法在乙氧酰胺苯甲酯0.05～5.0 μg/mL的系列濃度范圍內(nèi)均呈良好線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.990。肌肉樣品中乙氧酰胺苯甲酯的檢測(cè)限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg；肝、腎樣品中乙氧酰胺苯甲酯的檢測(cè)限為50 μg/kg，定量限為100 μg/kg；各組織樣品中平均添加回收率均為70 % ～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于20%。該方法具有簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、定性準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：鴨、鵝可食組織；乙氧酰胺苯甲酯；殘留；高效液相色譜

中圖分類(lèi)號(hào)： O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0265-03

乙氧酰胺苯甲酯化學(xué)名為4-乙酰胺基-2-乙氧基苯甲酸甲酯，系一種抗原蟲(chóng)（球蟲(chóng)） 藥，主要與某些抗球蟲(chóng)藥合用作為抗球蟲(chóng)藥的增效劑用于家禽飼料中，如與氨丙啉、氨丙啉與磺胺喹[XCZ1.tif]啉混合用于控制雞球蟲(chóng)病，在國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用廣泛。蛋雞在產(chǎn)蛋期禁用，休藥期為3 d。如果中間停止用藥，球蟲(chóng)會(huì)再發(fā)育，故連續(xù)使用才有效果[1]。由于用藥時(shí)間較長(zhǎng)，藥物必然在肉中殘留，被人食用后會(huì)直接危害人體健康，所以我國(guó)規(guī)定了嚴(yán)格的休藥期，雞在上市或開(kāi)產(chǎn)前3 d必須停藥。由于科學(xué)知識(shí)的缺乏和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，畜牧業(yè)中不按國(guó)家規(guī)定濫用獸藥和超標(biāo)使用獸藥的現(xiàn)象普遍存在，這不僅影響到廣大人民群眾的日常生活，而且隨著我國(guó)加入WTO，國(guó)內(nèi)外貿(mào)易的頻繁往來(lái)，也嚴(yán)重影響到我國(guó)的出口創(chuàng)匯。

2002年發(fā)布的中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定乙氧酰胺苯甲酯在禽組織中的最高殘留限量為：肌肉500 μg/kg，肝和腎1 500 μg/kg。乙氧酰胺苯甲酯在雞體內(nèi)不發(fā)生代謝，以藥物原型排出。農(nóng)牧發(fā)[2001]38號(hào)文發(fā)布了動(dòng)物源食品中乙氧酰胺苯甲酯殘留檢測(cè)方法——高效液相色譜法，但是該標(biāo)準(zhǔn)只適用于雞的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟組織中的乙氧酰胺苯甲酯殘留量的檢測(cè)。因此，我們對(duì)鵝、鴨的肌肉、肝和腎組織中的乙氧酰胺苯甲酯殘留的檢測(cè)方法做了研究。本試驗(yàn)在已有的適用于雞組織中的乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)[2]的基礎(chǔ)上，改進(jìn)提取步驟，用高效液相色譜法檢測(cè)，使得試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、易行、耗時(shí)少。該方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低、重現(xiàn)性好、測(cè)定費(fèi)用低的特點(diǎn)，適用于定量檢測(cè)動(dòng)物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的殘留量。

1 材料和方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）（Waters公司）；MP200B天平；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（貝克曼公司）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（潤(rùn)濕BUCHI）；固相萃取裝置；XW-80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；HY-4調(diào)速多用振蕩器。

1.2 試劑

乙氧酰胺苯甲酯對(duì)照品：含量≥98.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇為色譜純（Fisher公司）；正己烷、丙酮、無(wú)水硫酸鈉（分析純）；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL） 稱(chēng)取乙氧酰胺苯甲酯對(duì)照品10.0 mg（精確到0.1 mg），用甲醇溶解并定溶至100 mL，置4 ℃儲(chǔ)存，有效期為1周。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液 量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度分別為5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05 μg/mL的對(duì)照溶液，供高效液相色譜分析，臨用前配制。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品前處理

1.4.1.1 提取

稱(chēng)取（5.00 ± 0.05） g勻漿試樣，置于 50 mL 具塞離心管中，加入乙腈15 mL，無(wú)水硫酸鈉10 g，正己烷10 mL，渦旋混合1 min，振蕩提取5 min，4 000 r/min離心10 min。用滴管吸取下層乙腈于雞心瓶中備用。向剩余沉淀物中再加入乙腈15 mL，重新提取1次，合并2次的乙腈提取液于同一雞心瓶中，于45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。取正己烷-丙酮（9 ∶1）5.0 mL溶解上述殘留物，超聲30 s，搖勻，然后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.4.1.2 凈化

硅酸鎂固相萃取柱用甲醇5 mL預(yù)洗。取上述上清液1.0 mL過(guò)柱，用正己烷3 mL淋洗，擠干。用甲醇1.0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液，用0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜測(cè)定。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：C18柱，250 mm × 4.6 mm（i.d.）；流動(dòng)相：乙腈-水（30 ∶70）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 配制濃度為0.05、0.10、0.25、050、1.0、2.5、5.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相色譜測(cè)定后，乙氧酰胺苯甲酯峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.4 靈敏度 在空白鵝、鴨的肌肉組織中添加乙氧酰胺苯甲酯對(duì)照溶液，按確定的提取凈化方法處理后，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算信噪比。

1.4.5 準(zhǔn)確度與精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在鵝、鴨的組織中添加不同濃度乙氧酰胺苯甲酯進(jìn)行回收率試驗(yàn)。各濃度進(jìn)行5個(gè)平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)endprint

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)（圖1）回歸方程為：y=45 828x+177.61，r為0.999 9。

3 討論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本試驗(yàn)對(duì)徐士新等的提取方法[2]進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。修訂后的方法，在組織殘留提取時(shí)，同時(shí)加入乙腈、無(wú)水硫酸鈉和正己烷進(jìn)行提取，去掉了勻漿、過(guò)濾、靜置3個(gè)步驟，使耗材減少、操作更簡(jiǎn)單、減少了提取過(guò)程的的損失（降低了樣品的檢測(cè)限和定量限），節(jié)省了時(shí)間，使用修訂后的方法進(jìn)行添加回收測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果回收率均在80%以上。

3.2 色譜方法的優(yōu)化

液相方法首先通過(guò)色譜掃描確定檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度最高[4]；采用優(yōu)化流動(dòng)相乙腈與水的配比，發(fā)現(xiàn)在30 ∶70的條件下獲得的峰形最好；流速采用常用的 1.0 mL/min。綜合以上色譜優(yōu)化條件，可以獲得良好的試驗(yàn)結(jié)果。

4 小結(jié)

本方法采用乙腈提取、硅酸鎂固相萃取柱凈化，高效液相色譜法測(cè)定，成功建立了動(dòng)物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的殘留檢測(cè)方法。在鵝、鴨的肌肉中乙氧酰胺苯甲酯的檢測(cè)限為20 μg/kg，最低定量限為50 μg/kg。在鵝、鴨的肝臟、腎臟中乙氧酰胺苯甲酯的檢測(cè)限為50 μg/kg，最低定量限為 100 μg/kg。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，回收率較高，適用于動(dòng)物性食品中乙氧酰胺苯甲酯殘留的定量檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.4mm]

[1]丁佳雯，翁亞彪，朱建榮. 乙氧酰胺苯甲酯等藥物防治雞盲腸球蟲(chóng)病的療效試驗(yàn)[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治，2004（10）：2-3.

[2]徐士新，仲 鋒，郭文林. 乙氧酰胺苯甲酯在雞組織中殘留的檢測(cè)及消除規(guī)律的研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志，1999（3）：6-11.

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[4]Taahashi Y，Sekiya T，Nishikawa M，et al. Simultaneous high-performance liquid chromatographic determination of amprolium，ethopabate，sulfaquinoxaline and N4-acetylsulfaquinoxaline in chicken tissues[J]. Journal of Liquid Chromatography，1994，17（20）：4489-4512.endprint