王 璐 路書彥 仝瑩瑩

（河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南 鄭州 450004）

紅曲霉可利用多種碳源和氮源，合成多種色素、洛伐他汀等生理活性物質(zhì)。適當(dāng)強(qiáng)度的超聲波作用于液體培養(yǎng)過程，可提高微生物發(fā)酵的速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量。本文針對(duì)超聲波對(duì)紅曲霉液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物的影響進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株

紅曲霉（紫色紅曲，Monascus purpurcus）由長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：麥芽糖5%、豆芽汁20%、瓊脂2%～3%，0.1MPa滅菌25min；

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉6%、黃豆粉0.5%、KNO30.25%、ZnSO40.05%、MgSO40.05%，0.1Mpa滅菌25min；

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10%、酵母膏0.3%、KNO30.2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、FeSO40.001%，0.1Mpa滅菌25min；

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的培養(yǎng)

2.1.1 菌液的制備

菌懸液的制備：將斜面培養(yǎng)基上的菌株用40mL無菌水沖洗下來，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的150mL培養(yǎng)瓶中，震蕩后用6層無菌紗布過濾，濾液即為菌懸液。

種子液的制備：在250mL錐形瓶中加入72mL種子培養(yǎng)基，滅菌后接入3mL菌懸液，29℃振蕩培養(yǎng)36h。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將制備好的菌懸液按6%的接種量接入已滅菌的液體培養(yǎng)基，29℃搖床180rmp培養(yǎng)10d。

2.1.3 代謝產(chǎn)物分離

發(fā)酵液用濾紙過濾，收集濾出物烘干至恒重，即得紅曲霉菌絲干重；

濾液中取出1.5mL，12000rmp 離心10min，去上清進(jìn)行色素的測(cè)定。

2.2 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

所用培養(yǎng)設(shè)備為立式雙門回旋搖床，設(shè)置溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為141r/min。

將菌懸液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相應(yīng)時(shí)間進(jìn)行相應(yīng)超聲波處理。并留出24 瓶培養(yǎng)瓶作為對(duì)照。從培養(yǎng)第3天開始每天取出處理組和對(duì)照組各3瓶，進(jìn)行代謝產(chǎn)物的提取和測(cè)定。

本文基于2008年1月—2016年12月觀測(cè)數(shù)據(jù)，選取部分遠(yuǎn)震事件(震中處于30°～90°之間，震級(jí)M>6.0，清晰P波初至與高信噪比)作為研究對(duì)象(圖1)，研究區(qū)內(nèi)共有33個(gè)臺(tái)站，可以將重慶及周邊地區(qū)完全包含在內(nèi)(圖2)，研究所用數(shù)據(jù)皆來自于國家測(cè)震臺(tái)網(wǎng)數(shù)據(jù)備份中心[10]。

2.2.1 紅曲霉色素含量的測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，取出1.5mL，12000rmp 離心10min，取上清在380～550nm 處進(jìn)行紫外掃描。確定其紫外吸峰的波長(zhǎng)。

2.2.2 超聲波處理對(duì)紅曲霉代謝影響的單因素實(shí)驗(yàn)

所用設(shè)備為超聲波清洗儀，由處理次數(shù)，處理時(shí)間，處理強(qiáng)度，作用方式和作用功率的不同，設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn)。

由于處理次數(shù)過多，處理間隔短，單次處理時(shí)間過長(zhǎng)，處理功率過大都會(huì)導(dǎo)致菌絲球破裂菌體死亡，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)的摸索，確定單因素設(shè)置如表1。

表1 單因素及其水平的選擇

每個(gè)單因素單水平實(shí)驗(yàn)操作均為將菌懸液接入液體培養(yǎng)基中，放入29℃搖床中培養(yǎng)，共32 瓶。其中24 瓶為實(shí)驗(yàn)組（8瓶1組，3組重復(fù)），8瓶為空白組。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)水平的設(shè)置確定實(shí)驗(yàn)組處理方式進(jìn)行處理，從培養(yǎng)72h開始，每24h取出每組1瓶進(jìn)行代謝產(chǎn)物的測(cè)定，培養(yǎng)十天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

（1）確定使用功率為320W，處理時(shí)間為2min，開始作用時(shí)間為培養(yǎng)48h，間隔作用時(shí)間為24h。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為處理1次、2次和3次；并設(shè)置1個(gè)空白組。

（2）確定使用功率為320W，處理時(shí)間為1min，間隔作用時(shí)間為24h，共處理3次。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，開始處理時(shí)間分別為培養(yǎng)后48h、72h和96h；并設(shè)置1個(gè)空白組。

（3）確定使用功率為320W，開始作用時(shí)間為培養(yǎng)72h，間隔作用時(shí)間為24h，共處理3次。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為處理1min、2min和3min；并設(shè)置1個(gè)空白組。

（4）確定使用功率為320W，處理時(shí)間為1min，開始作用時(shí)間為培養(yǎng)72h，共處理3次。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，處理間隔時(shí)間分別為12h、24h和36h；并設(shè)置1個(gè)空白組。

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 超聲波處理次數(shù)對(duì)紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h 后，每24h 取出每組3 瓶，進(jìn)行代謝產(chǎn)物的測(cè)定，取得平均值進(jìn)行紅曲色素代謝曲線的繪制，結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果表明，超聲波處理能使紅曲色素的產(chǎn)量明顯增加，處理次數(shù)越多增強(qiáng)的效果越明顯。

2.3.2 超聲波處理方式對(duì)紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h后，每24h取出每組3瓶，進(jìn)行代謝產(chǎn)物的測(cè)定，取得平均值進(jìn)行紅曲色素代謝曲線的繪制。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，超聲波作用將改變紅曲霉紅色素和黃色素代謝曲線，在培養(yǎng)72h后開始進(jìn)行超聲波處理可得到最多的紅曲霉色素。

2.3.3 超聲波處理時(shí)間對(duì)紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h 后，每24h 取出每組3 瓶，進(jìn)行代謝產(chǎn)物的測(cè)定，取得平均值進(jìn)行代謝曲線的繪制。結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果表明，超聲波作用的時(shí)間和紅曲霉紅色素和黃色素的代謝量并不呈線性關(guān)系，得出超聲波對(duì)紅曲霉處理1min為超聲波處理時(shí)間的最優(yōu)條件。

2.3.4 超聲波處理間隔時(shí)間對(duì)紅曲霉紅曲色素代謝產(chǎn)物代謝的影響

培養(yǎng)72h 后，每24h 取出每組3 瓶，進(jìn)行代謝產(chǎn)物的測(cè)定，取得平均值進(jìn)行代謝曲線的繪制。結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果表明，超聲波處理的間隔時(shí)間長(zhǎng)短和紅曲霉紅色素和黃色素的代謝量無明顯關(guān)系，根據(jù)色素代謝的全過程，得出超聲波對(duì)紅曲霉以間隔時(shí)間為24h 處理時(shí)能得到最大的色素量。

圖1 超聲波處理次數(shù)與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關(guān)系

圖2 超聲波處理方式與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關(guān)系

圖3 超聲波處理方式與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關(guān)系

圖4 超聲波處理方式與紅曲色素中色素產(chǎn)量的關(guān)系

2.4 結(jié)論

微生物的發(fā)酵受到許多因素的影響，如溫度、溶氧量、培養(yǎng)基、菌種、pH值等，其中任何一個(gè)因素發(fā)生變化，都有可能引起細(xì)胞產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定性發(fā)生巨大的變化。研究發(fā)現(xiàn)，在紅曲霉培養(yǎng)72h后進(jìn)行超聲波處理，間隔每24h 處理1 次共處理3 次，處理時(shí)間為1min，使用功率為320W 的超聲波處理為紅曲霉代謝產(chǎn)品最優(yōu)處理?xiàng)l件。

［1］劉雷萍.紅曲中生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2003（9）：90-93.

［2］ 楊勝利，王金宇，鄒彥平，等.超聲波照射對(duì)紅曲Monacolin K 產(chǎn)量的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，29（2）：66-68.

［3］郭紅珍，王秋芬，馬立芝.不同培養(yǎng)條件對(duì)紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（1）：215-218.

［4］ 楊勝利，王金宇，鄒彥平，等.超聲波照射對(duì)紅曲Monacolin K 產(chǎn)量的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，29（2）：66-68.