于代華，孫緒德，柴 偉，高昌俊

（第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院麻醉科，西安 710038）

針對急性腦損傷神經(jīng)保護的研究雖然很多，但是目前尚沒有一種理想的藥物應用于臨床，因此，尋找新型高效的腦保護藥物以防治急性腦損傷是臨床上亟待解決的難題。近年研究發(fā)現(xiàn)，重組人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rh－EPO）不僅對腎臟具有保護作用［1－3］，對心臟［4－7］和中樞神經(jīng)系統(tǒng)同樣具有良好的保護作用，是對預防和治療急性腦損傷具有很好的臨床應用前景［8－9］。研究表明rh－EPO可降低缺血缺氧導致的細胞外谷氨酸濃度升高、降低谷氨酸誘導的神經(jīng)細胞死亡、減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的缺血再灌注損傷，在基礎與臨床研究中均表現(xiàn)出對腦缺血再灌注的保護作用［10］。但rh－EPO并非通過增加紅細胞容積來發(fā)揮神經(jīng)保護作用［11］，目前其作用機制，尤其是細胞內(nèi)信號機制還不明確，為臨床的進一步應用帶來困難，成為一個亟待解決的涉及基礎理論的臨床問題。

本實驗擬在大鼠急性腦損傷模型的基礎上，以谷氨酸轉運體GLT－1和GLAST信號通路為切入點，研究rh－EPO對急性腦損傷的保護作用及對GLT－1和GLAST表達的影響，以闡明GLT－1和GLAST信號通路在rh－EPO誘導急性腦損傷保護機制中的作用，為探討急性腦損傷保護提供新的手段和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 rh－EPO注射液（國藥準字號S20010001，10000國際單位／支）由沈陽三生制藥股份有限公司生產(chǎn)。大鼠GLT－1、GLAST ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。Bio－Rad蛋白定量試劑盒、熒光染料SYBR GreenⅡ購自上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 實驗分組 60只SD大鼠（300～350g，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供）分為3組：對照組（n＝18）、急性腦損傷組（n＝22）和rh－EPO處理組（n＝20），急性腦損傷組和EPO處理組用自由落體打擊器制作腦外傷模型，rh－EPO處理組在制作腦損傷模型15min后經(jīng)腹腔注射rh－EPO 3000 U／kg。各組大鼠實驗完成48h后，3%戊巴比妥（10mg／kg）過量麻醉，立即斷頭取腦。

1.3 急性腦損傷模型的制備［12］采用改良Feeney′s自由落體打擊器制作急性腦損傷模型。將大鼠提前3d單獨喂養(yǎng)，術前禁食8h。實驗時用10%水合氯醛以350mg／kg體質量腹腔注射進行麻醉，俯臥位固定于腦立體定向儀（江灣1型）上。消毒皮膚，正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm，中線旁2.5mm處鉆一直徑5.0mm骨窗，保持硬膜完整。將撞桿置于硬膜上，用20g砝碼于30cm高處沿外周導管墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，致右頂葉輕度腦挫裂傷，致傷沖擊力大小為600g／cm。打擊后切口內(nèi)滴注4×104U硫酸慶大霉素4～5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。對照組僅開顱窗后用骨蠟封閉，不施加打擊。

1.4 RT－PCR 檢測 GLT－1和 GLAST mRNA表達量變化提取各組組織勻漿總RNA，行反轉錄獲得cDNA模板。引物設計采用Primer Express（ABI公司，美國），在Prism 7500real time－PCR儀（ABI公司，美國）上進行反應擴增。設計GLT－1引物序列：上 游 5′－CAG AGG GAC AAC AGC AAT GA－3′，下游5′－CCG TGT AAA CCA AAG CCT A－3′，擴增片段長度為299bp。退火溫度為51℃，32次循環(huán)。用β－actin作為內(nèi)參照，采用熒光染料SYBR GreenⅡ進行標記，用ABI Prism 7500SDS軟件分析PCR反應獲得的數(shù)據(jù)。

1.5 Western blot檢測GLT－1和GLAST蛋白量的變化 將收集的組織勻漿用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解，然后用Bio－Rad蛋白定量試劑盒（Bio－Rad公司，美國）進行蛋白定量。取20μg處理好的蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析，然后轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，將PVDF膜與第一抗體（1∶1000）4℃孵育過夜；PBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入第二抗體室溫孵育1h，再次洗膜3次，每次10min。使用化學發(fā)光法顯影檢測目的蛋白的條帶變化，并以β－actin作為對照。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，組間比較采用方差分析（ANOVA）處理，組內(nèi)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

大鼠腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST mRNA表達量以相對端粒酶活性表示，與對照組比較，急性腦損傷后48h，急性腦損傷組腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST mRNA表達較對照組均顯著降低（P＜0.01）；與急性腦損傷組比較，rh－EPO處理組 GLT－1和GLAST mRNA表達均顯著增加（P＜0.01）。見圖1。

與對照組比較，急性腦損傷后48h，急性腦損傷組腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST蛋白表達均顯著降低（P＜0.01）；與急性腦損傷組比較，rh－EPO處理組GLT－1和GLAST蛋白表達均顯著增加（P＜0.01）。見圖2。

圖1 RT－PCR檢測各組GLT－1和GLAST mRNA表達變化（n＝10）

圖2 Western blot檢測各組GLT－1和GLAST蛋白表達變化（n＝10）

3 討 論

一般認為，EPO作為一種促紅細胞生長因子，可促進造血干細胞的增殖與分化。近年來許多研究均表明EPO除了增加紅細胞容積之外，對重要器官如腎臟、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的缺血缺氧性損傷具有明確的保護作用。此前對于EPO是否能透過血腦屏障的問題也曾有過爭議，有學者提出，EPO是一種分子量巨大的糖蛋白，靜脈注射不能透過血腦屏障到達腦部，但Brines等［13］研究表明，EPO是一種能被選擇性轉運的大分子物質，在缺乏神經(jīng)損傷時，EPO可以由血液循環(huán)透過血腦屏障進入腦實質。將rh－EPO進行生物素標記后發(fā)現(xiàn)，靜脈注射5 h后可在動物血腦屏障微血管周圍觀察到生物素標記的rh－EPO并且進入了腦實質，說明rh－EPO是可以透過血腦屏障的。另外，血腦屏障受損也可使rh－EPO加速通過血腦屏障。

大量動物和臨床實驗證實，缺血缺氧時腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質谷氨酸大量釋放，細胞外高谷氨酸濃度與神經(jīng)損傷密切有關，這也可能是導致腦細胞損傷的主要原因［14］。谷氨酸既是一種神經(jīng)遞質，同時也具有興奮性神經(jīng)毒性，細胞外過高的谷氨酸產(chǎn)生的神經(jīng)毒性可導致神經(jīng)細胞死亡。在正常情況下，谷氨酸儲存于突觸前的囊泡內(nèi)，當動作電位到達神經(jīng)接頭時，谷氨酸被釋放到突觸間隙，將神經(jīng)沖動的信號傳遞到突觸后神經(jīng)元。通常，釋放到突觸間隙的谷氨酸主要由星型膠質細胞的谷氨酸轉運體GLT－1和GLAST回收到細胞內(nèi)，在星形膠質細胞內(nèi)被轉變成谷氨酰胺，然后安全地轉運到神經(jīng)元。過表達GLT－1可明顯降低缺氧導致的腦損傷［15］。在多種表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸轉運體中，GLT－1和GLAST主要表達在星形膠質細胞，類似于離子通道樣作用的GLT－1和GLAST回吸收了90%的遞質性谷氨酸，在調(diào)節(jié)突出間隙興奮性谷氨酸濃度中起重要作用。用GFAP啟動子控制的星形膠質細胞特異過表達GLT－1，在氧糖剝奪實驗性腦片中對神經(jīng)細胞具有明顯保護作用［16－17］。在病理條件下，如果 GLT－1和 GLAST的轉運活性下降或表達下調(diào)，可導致胞外谷氨酸濃度升高并引起興奮性神經(jīng)毒性。此時，谷氨酸轉運體也可能發(fā)生雙向轉運，將細胞內(nèi)的谷氨酸轉運到胞外，增加谷氨酸的神經(jīng)毒性［18］。除膠質細胞外，神經(jīng)元也少量表達GLT－1和GLAST，轉運少量谷氨酸進入細胞。

EPO對急性腦損傷的保護作用是目前國內(nèi)外研究的熱點，但目前機制仍不十分清晰［19－22］。本研究結果表明，急性腦損傷后48h，大鼠腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST表達顯著降低，而rh－EPO處理后GLT－1和GLAST較急性腦損傷組顯著增加，說明GLT－1／GLAST信號機制在rh－EPO對急性腦損傷的保護作用中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，rh－EPO可以有效減輕急性腦損傷，減少損傷區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的數(shù)量，具有明確的腦保護作用。但rh－EPO的這種急性腦保護作用并非來源于rh－EPO本身的促紅細胞生成活性，可能與上調(diào)GLT－1和GLAST的轉運活性和表達水平有關。

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