急性切口痛大鼠血漿及上消化道胃動(dòng)素表達(dá)的變化

趙軍，徐磊，張瑜，馮全勝

急性切口痛大鼠血漿及上消化道胃動(dòng)素表達(dá)的變化

趙軍1，徐磊2△，張瑜3，馮全勝2

目的觀察急性切口痛大鼠血漿、胃體及十二指腸胃動(dòng)素（MTL）水平的變化。方法SPF級(jí)健康雄性SD大鼠156只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為2組（n=78）：對(duì)照組（C組）和切口痛組（P組）。P組行右足跖肌切口。2組先隨機(jī)各取6只大鼠，于術(shù)前24 h（T0）、術(shù)后1 h（T1）、6 h（T2）、24 h（T3）、48 h（T4）、72 h（T5）測(cè)定機(jī)械縮足閾值（PWMT）與熱縮足反射潛伏期（PWTL）。并于上述每個(gè)時(shí)點(diǎn)，2組分別取12只大鼠，斷頭處死，提取血漿、胃體及十二指腸組織，采用ELISA法測(cè)定MTL水平。結(jié)果與C組比較，P組T1～T4時(shí)PWMT降低，PWTL縮短，血漿、胃體MTL水平降低，而十二指腸MTL水平升高（P＜0.05），T0、T5時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P組血漿MTL水平與PWMT、PWTL呈正相關(guān)（r分別為0.952、0.879，P＜0.01），P組胃體MTL水平與PWMT、PWTL呈正相關(guān)性（r分別為0.970、0.931，P＜0.01）；十二指腸MTL水平與PWMT、PWTL呈負(fù)相關(guān)性（r分別為-0.991、-0.975，P＜0.01）。結(jié)論急性切口痛可使大鼠血漿、胃體MTL水平降低，而使十二指腸MTL水平升高。

促胃動(dòng)素；胃；十二指腸；血漿；急性切口痛

術(shù)后急性痛可引發(fā)嚴(yán)重胃腸功能紊亂，影響患者預(yù)后［1］。胃動(dòng)素（motilin，MTL）由腸嗜鉻細(xì)胞分泌，主要分布在胃、十二指腸、空腸及血漿，于消化間期呈周期性釋放，在胃腸動(dòng)力調(diào)控中發(fā)揮重要作用［2-3］，其表達(dá)主要受迷走神經(jīng)下游的膽堿能神經(jīng)及非腎上腺非膽堿能神經(jīng)通路調(diào)控［4］。研究顯示，急性切口痛抑制胃體MTL表達(dá)，降低胃動(dòng)力，但其對(duì)外周其他部位MTL表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)影響尚鮮見(jiàn)報(bào)道［5］。本研究擬觀察切口痛大鼠血漿、胃體、十二指腸MTL水平的動(dòng)態(tài)變化，為臨床嚴(yán)重胃腸功能紊亂的外周機(jī)制研究及治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠156只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心，每籠5只飼養(yǎng)，自然照明，自由攝食、飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為2組（n=78）：對(duì)照組（control group，C組）和切口痛組（incisional pain group，P組）。

1.3疼痛模型建立參照文獻(xiàn)［6］方法制備切口痛模型。吸入七氟醚麻醉后右足底近端0.5 cm處向趾部做一長(zhǎng)約1 cm切口，切開皮膚筋膜，用眼科鑷挑起足底跖肌并縱向切割，但保持肌肉起止及附著完整，皮膚縫合，切口以青霉素藥液沖洗。

1.4檢測(cè)方法及觀察指標(biāo)2組先隨機(jī)各取6只大鼠，于術(shù)前24 h（T0）、術(shù)后1 h（T1）、6 h（T2）、24 h（T3）、48 h（T4）、72 h （T5）測(cè)定機(jī)械縮足閾值（PWMT）與熱縮足反射潛伏期（PWTL）。C組、P組剩余大鼠于上述每個(gè)時(shí)點(diǎn)分別取12只大鼠斷頭處死，取胃體、十二指腸組織并經(jīng)下腔靜脈抽取血樣，采用ELISA法測(cè)定MTL水平。

1.4.1PWMT將一透明有機(jī)玻璃箱（22 cm×22 cm×12 cm）置于30 cm高的金屬篩網(wǎng)（1 cm×1 cm）上，待大鼠在箱中適應(yīng)30 min后，采用電子von Frey纖維絲（IITC公司，美國(guó)），垂直刺激大鼠雙側(cè)后足與附近第3、4趾間皮膚，每次持續(xù)4～6 s。大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，并記錄此時(shí)的刺激強(qiáng)度，每次間隔15 s以上，共刺激5次，計(jì)算其平均值為PWMT。

1.4.2PWTL將有機(jī)玻璃箱置于3 mm厚玻璃板上，大鼠放入箱內(nèi)，使其自由活動(dòng)30 min以適應(yīng)測(cè)試環(huán)境和溫度。室溫穩(wěn)定在24～26℃。采用Model 390 Heated Base熱痛刺激儀（IITC公司，美國(guó)）照射大鼠足底緊貼玻璃板部位，具體部位同PWMT測(cè)定部位。記錄照射開始至大鼠出現(xiàn)抬足或舔足時(shí)間，照射時(shí)間不超過(guò)20 s，以防止組織損傷。測(cè)定5次，間隔至少5 min，取后3次刺激的平均值為PWTL。

1.5MTL水平測(cè)定 （1）血MTL。開腹，經(jīng)下腔靜脈采集血樣2 mL，置于含30 μL10%EDTA二鈉和40 μL抑肽酶（2萬(wàn)U/mL）試管中混勻，4℃離心20 min。取血漿，置-20℃保存。采用ELISA法測(cè)定MTL水平，ELISA試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司。（2）胃體、十二指腸MTL。胃體、十二指腸黏膜組織分別稱質(zhì)量，置于含1 mL濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液勻漿器中勻漿。沸水煮沸10 min，4℃、3 500 r/min離心半徑13.5 cm，離心10 min。取上清放入試管中冰凍、干燥、濃縮后PBS等容，待測(cè)液-80℃保存，采用ELISA法測(cè)定MTL水平，ELISA試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1機(jī)械痛閾值比較與C組比較，P組T1～T4時(shí)PWMT降低（P＜0.05），T0、T5時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P組PWMT T1時(shí)降低，T3～T5時(shí)逐漸升高（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1　Comparison of PWMT variation at different time points between two groups表1 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)PWMT的比較（n=6，g，±s）

Tab.1　Comparison of PWMT variation at different time points between two groups表1 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)PWMT的比較（n=6，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；t1為組間比較，t2為組內(nèi)與前一時(shí)點(diǎn)比較；表2～5同

T0T1t2T2t2組別C組P組2.026 35.259＊＊0.793 2.298 t1 42±7 40±3 0.757 45±7 21±4 14.367＊＊43±7 18±6 11.985＊＊t2 T3T4t2T5t2組別C組P組　t1 43±5 25±8 10.821＊＊0.932 5.657＊＊44±5 30±9 5.902＊＊2.038 2.828＊43±7 42±5 0.519 0.711 6.445＊

2.2熱輻射痛閾值比較與C組比較，P組T1～T4時(shí)PWTL降低（P＜0.05），T0、T5時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P組PWTL T1時(shí)降低，T3時(shí)較T1、T2升高（P＜0.05），T3～T5時(shí)逐漸升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2　Comparison of PWTL variation at different time points between two groups表2 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)PWTL的比較（n=6，g，±s）

Tab.2　Comparison of PWTL variation at different time points between two groups表2 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)PWTL的比較（n=6，g，±s）

T1 T0t2T2t2組別C組P組0.286 5.443＊＊0.091 0.091 t1 11.3±5.3 11.8±5.1 0.213 11.7±2.1 6.2±2.1 6.753＊＊11.6±4.2 5.9±2.7 9.051＊＊組別C組P組T3t2T4t2T5t22.431 3.181＊12.5±7.3 9.7±3.2 8.925＊＊12.9±3.9 8.3±3.7 7.656＊＊0.088 3.208＊0.069 2.723＊t1 12.1±3.4 11.3±4.1 0.427

2.3血漿MTL水平比較與C組比較，P組T1～T4時(shí)血漿MTL水平降低（P＜0.05），T0、T5時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P組MTL T1時(shí)降低，T3～T5時(shí)逐漸升高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3　Comparison of plasma levels of MTL at different time points between two groups表3 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)血漿MTL水平的比較（n=12，pmol/L，±s）

Tab.3　Comparison of plasma levels of MTL at different time points between two groups表3 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)血漿MTL水平的比較（n=12，pmol/L，±s）

T0T1t2T2t2組別C組P組0.300 18.465＊＊0.232 0.432 t1 239±17 239±14 0.745 236±11 144±12 18.835＊＊239±6 146±20 20.246＊＊T3t2T4t2T5t2組別C組P組0.09 3.479＊1.462 9.830＊＊0.399 10.126＊＊t1 241±5 189±23 10.978＊＊235±7 205±21 10.449＊＊239±11 244±17 0.032

2.4胃體MTL水平比較與C組比較，P組T1～T4時(shí)胃體MTL水平降低（P＜0.05），T0、T5時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P組MTL T1時(shí)降低，T3～T5時(shí)逐漸升高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

Tab.4　Comparison of MTL levels in gastric body at different time points between two groups表4 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)胃體MTL水平的比較（n=12，pmol/L，±s）

Tab.4　Comparison of MTL levels in gastric body at different time points between two groups表4 2組大鼠各時(shí)點(diǎn)胃體MTL水平的比較（n=12，pmol/L，±s）

T0T1t2T2t2組別C組P組t1 511±12 516±11 0.745 509±7 236±9 64.816＊＊1.287 337.000＊＊505±9 221±15 40.076＊＊0.952 0.268 T4 T3t2t2T5t2組別C組P組1.521 14.439＊＊0.932 5.246＊＊1.352 30.042＊＊t1 513±10 274±12 30.041＊＊516±9 300±7 37.785＊＊503±13 487±13 0.595

2.5十二指腸MTL水平比較與C組比較，P組T1～T4時(shí)十二指腸MTL水平升高（P＜0.05），T0、T5時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P組MTL T1時(shí)升高，T3～T5時(shí)逐漸降低（P＜0.05），見(jiàn)表5。

Tab.5　Comparison of MTL levels in duodenum at different time points between two groups表5　2組大鼠各時(shí)點(diǎn)十二指腸MTL水平的比較（n=12，pmol/L，±s）

Tab.5　Comparison of MTL levels in duodenum at different time points between two groups表5　2組大鼠各時(shí)點(diǎn)十二指腸MTL水平的比較（n=12，pmol/L，±s）

組別C組P組T0T1t2T2t20.893 5.876＊＊230±10 327±13 11.488＊＊233±6 231±9 0.931 0.945 31.096＊＊t1 226±7 361±21 7.595＊＊組別C組P組T3t2T4t2T5t21.021 13.900＊＊231±15 283±19 7.061＊＊236±11 309±16 8.537＊＊0.871 5.376＊＊1.058 15.637＊＊t1 227±13 229±15 0.158

2.6相關(guān)性分析P組血漿MTL水平與PWMT、PWTL均呈正相關(guān)（r分別為0.952、0.879，P＜0.05），胃體MTL水平與PWMT、PWTL均呈正相關(guān)（r分別為0.970、0.931，P＜0.01），十二指腸MTL水平與PWMT、PWTL均呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.991、-0.975，P＜0.01）。

3　討論

MTL為腦腸肽，其與胃動(dòng)素受體（MTLR）結(jié)合激活下游MLCK信號(hào)通路，引起胃腸道平滑肌收縮，從而增加胃腸動(dòng)力［7］。研究發(fā)現(xiàn)，胃輕癱患者血漿MTL水平顯著降低，靜脈給予MTL后癥狀明顯改善，而腸易激綜合征大鼠血漿MTL表達(dá)顯著升高，這提示胃腸動(dòng)力狀態(tài)與血漿MTL表達(dá)存在正相關(guān)［8-9］。以往研究顯示，手術(shù)可導(dǎo)致全胃腸道蠕動(dòng)下降，甚至誘發(fā)麻痹性腸梗阻［10］。但本研究結(jié)果顯示，急性切口痛對(duì)外周水平MTL表達(dá)的影響趨勢(shì)存在差異，可抑制血漿、胃體MTL表達(dá)，降低胃動(dòng)力，而增加十二指腸MTL表達(dá)，升高十二指腸動(dòng)力，表明其對(duì)不同部位胃腸道MTL的影響存在顯著差異，這提示胃腸道可能存在多種機(jī)制參與急性痛對(duì)MTL的調(diào)控。傷害性刺激誘發(fā)炎癥反應(yīng)，通過(guò)神經(jīng)反射及炎癥因子作用產(chǎn)生急性疼痛、興奮交感神經(jīng)，進(jìn)而抑制迷走神經(jīng)，其下游膽堿能神經(jīng)通路及非腎上腺非膽堿能神經(jīng)通路受到抑制，前者主要支配胃部MTL表達(dá)，其興奮可促使胃部腸嗜鉻細(xì)胞分泌MTL增加，后者在十二指腸MTL調(diào)控發(fā)揮主要作用，抑制該部位腸嗜鉻細(xì)胞分泌MTL，當(dāng)該神經(jīng)受到抑制后，可使該部位分泌MTL增加。而由于消化道多數(shù)部位受膽堿能神經(jīng)支配，因而外周整體MTL分泌下降，進(jìn)入血液循環(huán)中的MTL濃度下降，引起血漿MTL表達(dá)降低。

本研究結(jié)果還顯示，血漿、胃體MTL水平與PWMT和PWTL各對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)均呈正相關(guān)；而十二指腸MTL水平與PWMT和PWTL各對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)均呈負(fù)相關(guān)；急性疼痛的程度與交感神經(jīng)興奮程度呈正相關(guān)，這提示術(shù)后急性痛可能通過(guò)交感-迷走神經(jīng)的興奮程度來(lái)影響血漿、胃體、十二指腸MTL的表達(dá)。

臨床工作中，危重癥（如膿毒癥）患者常出現(xiàn)胃輕癱［11］及腹瀉并存等胃腸功能紊亂癥狀，甚至出現(xiàn)胃腸功能衰竭［12］，導(dǎo)致菌群失調(diào)，腹壓升高，胃腸道黏膜缺血缺氧，出現(xiàn)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)障礙，甚至導(dǎo)致死亡。本研究結(jié)果顯示疼痛導(dǎo)致MTL在不同胃腸道部位的表達(dá)存在差異，可能為危重癥患者胃腸功能紊亂的機(jī)制研究提供新的思路。臨床上長(zhǎng)期缺乏可靠的評(píng)估胃腸功能狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)室檢查。本研究結(jié)果顯示，急性痛對(duì)胃體與血漿MTL表達(dá)的影響趨勢(shì)一致，而十二指腸與血漿MTL的表達(dá)趨勢(shì)相反。是否可用血漿MTL來(lái)評(píng)估胃及十二指腸動(dòng)力狀態(tài)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究?jī)H對(duì)胃、十二指腸MTL表達(dá)進(jìn)行了觀察，而食管、小腸、結(jié)直腸等其他消化道情況尚不清楚，同時(shí)，沒(méi)有對(duì)胃腸道動(dòng)力的實(shí)際狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，這提示有必要進(jìn)一步全面深入研究，掌握急性疼痛及嚴(yán)重創(chuàng)傷、炎癥等刺激對(duì)全消化道的影響，為臨床胃腸功能衰竭的機(jī)制研究及治療提供依據(jù)。

［1］Ledowski T，Stein J，Albus S，et al.The influence of age and sex on the relationship between heart rate variability，haemodynamic variables and subjective measures of acute post-operative pain［J］.Eur J Anaesthesiol，2011，28（6）:433-437.doi:10.1097/EJA.0b013e328343d524.

［2］Zhao J，Gao B，Zhang Y，et al.Effects of intrathecal opioids combined with low-dose naloxone on motilin and its receptor in a rat model of postoperative pain［J］.Life Sciences，2014（103）:88-94. doi:10.1016/j.lfs.2014.03.032.

［3］Xu L，Gao S，Guo F，et al.Effect of motilin on gastric distension sensitive neurons in arcuate nucleus and gastric motility in rat［J］.Neurogastroenterol Motil，2011，23（3）:265-270.doi:10.1111/j.1365-2982.2010.01661.x.

［4］Javid FA，Bulmer DC，Broad J，et al.Anti-emetic and emetic effects of erythromycin in Suncus murinus:Role of vagal nerve activation，gastric motility stimulation and motilin receptors［J］.Eur J Pharmacol，2013，699（1-3）:48-54.doi:10.1016/j.ejphar.2012.11.035.

［5］Zhang Y，Zhao J，Gao BZ，et al.Changes in levels of motilin in gastric body in a rat model of incisional pain［J］.Chinese Journal of Anesthesiology，2013，33（6）:697-700.［張瑜，趙軍，高寶柱，等.切口痛大鼠胃體胃動(dòng)素水平的變化［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2013，33（6）: 697-700］.doi:10.3760/cma.j.issn.0254-1416.2013.06.013.

［6］Brennan TJ，Vandermeulen EP，Gebhart GF.Characterization of a rat model of incisional pain［J］.Pain，1996，64（3）:493-501.

［7］Huang J，Zhou H，Mahavadi S，et al.Signaling pathways mediating gastrointestinal smooth muscle contraction and MLC20 phosphorylation by motilin receptors［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005，288（1）:G23-G31.doi:10.1152/ajpgi.00305.2004.

［8］Hasler WL.Emerging drugs for the treatment of gastroparesis［J］.Expert Opin Emerg Drugs，2014，19（2）:261-279.doi:10.1517/ 14728214.2014.899353.

［9］Liang C，Luo H，Liu Y，et al.Plasma hormones facilitated the hypermotility of the colon in a chronic stress rat model［J］.PLoS One，2012，7（2）:e31774.doi:10.1371/journal.pone.0031774.

［10］Boeckxstaens GE，Hirsch DP，Kodde A，et al.Activation of an adrenergic and vagally-mediated NANC pathway in surgery-induced fundic relaxation in the rat［J］.Neurogastroenterol Motil，1999，11 （6）:467-474.

［11］Song MH，Zhu GJ，Ma L，et al.Comparative analysis of bilirubin in correlation to ALB between nephrotic syndrome patients and postoperative gastroparesis syndrome patients［J］.Genet Mol Res，2014，13 （4）:9403-9411.doi:10.4238/2014.February.14.13

［12］Derek C，Tom P.Severe Sepsis and Septic Shock［J］.N Engl J Med，2013，369:840-851.doi:10.1056/NEJMra1208623.

（2014-09-25收稿2014-11-10修回）

（本文編輯李國(guó)琪）

Changes of motilin concentrations in plasma and upper gastrointestinal tract in rat model of acute incisional pain

ZHAO Jun1，XU Lei2△，ZHANG Yu3，F(xiàn)ENG Quansheng2
1 The Third Central Clinical College of Tianjin Medical University，Tianjin 300170，China；2 Department of Critical Care Medicine，the Third Central Hospital of Tianjin；3 Department of Anesthesiology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital
△Corresponding AuthorE-mail：nokia007008@163.com

ObjectiveTo observe changes of motilin（MTL）levels in gastric body，duodenum and plasma in rat model of acute incisional pain.MethodsA total of 156 healthy male adult SD rats，weighing 180-220 g，were randomized into two groups:control group（group C，n=78）and incisional pain group（group P，n=78），Rats in P group received incision on the right plantaris.Values of paw withdrawal mechanical threshold（PWMT）and paw withdrawal thermal latency（PWTL）at different time points of 24 hours before operation（T0）and 1 hour（T1），6 hours（T2），24 hours（T3），48 hours（T4）and 72 hours（T5）after operation were measured in six rats chosen randomly from each group.Twelve rats were chosen from each group at T0-5，and sacrificed.The MTL levels in plasma，the mucosal tissues of gastric body and duodenum were detected by ELISA.ResultsCompared with group C，PWMT and PWTL were significantly decreased at T1-4in group P.The MTL levels were significantly decreased in plasma and gastric body（P＜0.05）.The MTL level was significantly increased at T1-4in duodenum （P＜0.05），and no significant changes were found at T0and T5in P group（P＞0.05）.The plasma MTL levels were positively correlated with PWMT and PWTL（r=0.952，r=0.879，respectively，P＜0.01）in P group.The MTL levels in gastric body were positively correlated with PWMT and PWTL（r=0.970，r=0.931，respectively，P＜0.01）in P group.The MTL levels were negatively correlated with PWMT and PWTL（r=-0.991，r=-0.975，respectively，P＜0.01）in duodenum in P group.ConclusionThe MTL levels in plasma and gastric body are decreased in rat model of acute incisional pain，and increased in duodenum.

motilin；stomach；duodenum；plasma；acute incisional pain

R614

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.011

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2012KY03）

1天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院（郵編300170）；2天津市第三中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科

趙軍（1979），男，碩士在讀，主要從事急性疼痛及胃腸動(dòng)力基礎(chǔ)研究

△E-mail：nokia007008@163.com