精子保存方法在黃顙魚規(guī)模化繁殖中的應(yīng)用

唐忠林　茆健強(qiáng)　周國勤等

摘要： 以受精率為標(biāo)準(zhǔn)，通過黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）繁苗試驗(yàn)，分析了3種保存液在黃顙魚規(guī)模化生產(chǎn)中的應(yīng)用效果。結(jié)果表明，應(yīng)用黃顙魚精子保存專用液的授精效果較佳，當(dāng)雌雄配組比例分別為500 ∶ 1、250 ∶ 1、50 ∶ 1時(shí)，3組之間的受精率均不存在顯著差異。規(guī)模繁殖生產(chǎn)中，授精時(shí)間控制在1 5 h內(nèi)，可將單尾雄魚配組繁殖的雌魚數(shù)量提高到300～500尾，有效提升黃顙魚雄魚使用及規(guī)?；泵缧?。

關(guān)鍵詞： 黃顙魚；規(guī)?；敝常皇芫剩痪颖４?；受精率

中圖分類號： S961 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0226-02

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）屬鲇形目鲿科黃顙魚屬，是小型底棲經(jīng)濟(jì)魚類，在我國各大水系均有分布。黃顙魚肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、無肌間刺，深受廣大消費(fèi)者歡迎。近年來，江蘇省各地區(qū)已廣泛開展了黃顙魚池塘養(yǎng)殖，但其種苗規(guī)模生產(chǎn)問題未能得到很好解決，主要存在親本量需求大、勞動強(qiáng)度大、雌雄魚發(fā)情時(shí)間難以同步及需要大量殺雄魚采精等問題 [1-2]。開發(fā)應(yīng)用黃顙魚精子保存技術(shù)有助于提高黃顙魚精子利用率，減少雄親魚宰殺量及勞動量，提高繁苗效率，提升經(jīng)濟(jì)效益。有關(guān)黃顙魚精子生理特性、保存液配方及保存條件研究已有報(bào)道 [3-7]，但有關(guān)保存方法在黃顙魚規(guī)?；a(chǎn)中的應(yīng)用效果研究報(bào)道較少。本研究篩選出授精效果較好的精子保存液，確定適宜的雌雄配組比例及繁殖時(shí)間，旨在為促進(jìn)黃顙魚規(guī)?；敝程峁┮罁?jù)。

1 材料與方法

1 1 材料

黃顙魚親本均為江蘇省南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所黃橋?yàn)┟绶N繁育場自行培育，黃顙魚雄魚平均規(guī)格達(dá)0 2 kg，雌魚平均規(guī)格達(dá)0 1 kg，親魚體表無傷無病，發(fā)育情況良好。電子秤，1、5 mL移液槍，著卵網(wǎng)片，玻璃瓶等。

1 2 精子保存液制備

選擇A、B、C 共3種精子保存液 [6-8]。精子保存液A為黃顙魚精子保存專用液：NaCl 7 68 g，KCl 0 22 g，NaHCO3 025 g，NaCO3 0 21 g，葡萄糖2 g/L蒸餾水。精子保存液B為漁用任式液：NaCl 7 8 g，KCl 0 20 g，CaCl2 0 21 g，NaHCO3 0 021 g/L蒸餾水。精子保存液C為生理鹽水：NaCl 7 g/L蒸餾水。

1 3 精子采集與保存

試驗(yàn)魚捕撈后暫養(yǎng)于水泥池，采精前12 h對雄魚注射促黃體素釋放激素A2（LHRH-A2）、絨促性素（HCG）、馬來酸地歐酮（DOM），以促進(jìn)精子成熟。采集精子時(shí)剖開雄魚腹腔，用鑷子取出精巢（2 mg/尾），去除血絲，在干凈的培養(yǎng)皿中剪碎，紗網(wǎng)過濾，將單尾雄魚的精液收集到各精子保存液中，保存液均為25 mL。整個(gè)取精過程在人工授精前0 5 h內(nèi)快速完成，避免精子與水接觸，常溫下避光保存。

1 4 黃顙魚人工授精

黃顙魚規(guī)模化生產(chǎn)過程中，根據(jù)不同雌雄配比條件，通過人工授精來驗(yàn)證3種保存液在2 h內(nèi)常溫保存的精子授精效果。在人工授精前24 h對雌魚注射漁用HCG、LHRH-A2、DOM混合藥物，以促使其卵子成熟。待90%以上雌魚卵子成熟后（可輕松擠出）進(jìn)行人工授精，擠壓雌魚的腹部，使魚卵排入無水的不銹鋼盆中，避免魚卵與水接觸。用移液槍取保存的精液，加入0 3%鹽水激活，迅速倒入卵盆中，人工攪拌均勻，使卵子和精子充分結(jié)合授精，再將受精卵均勻布置在著卵網(wǎng)片上，在充氣及流水條件下孵化，10 h后觀察并計(jì)數(shù)受精卵，統(tǒng)計(jì)其受精率。

1 5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

探討不同保存液配方、不同雌雄配組比例、不同保存時(shí)間3個(gè)條件對黃顙魚精子保存液的授精效果，對比A、B、C 3種精子保存液授精效果，并確定黃顙魚規(guī)?；a(chǎn)中適宜的雌雄配組授精比例。經(jīng)測量，單尾雌魚擠出卵的平均質(zhì)量為13 74 g，試驗(yàn)過程中采用的卵量均按這一標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，各試驗(yàn)組使用的魚卵量及精液量見表1。

1 6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

隨機(jī)抽取各試驗(yàn)組布卵網(wǎng)片9片，每片隨機(jī)抽取3個(gè)約12 cm2的區(qū)域，統(tǒng)計(jì)其受精率，再計(jì)算各組平均值，應(yīng)用SigmaPlot軟件分析數(shù)據(jù)差異性。

2 結(jié)果與分析

2 1 3種保存液在不同雌雄比例配組中的授精效果

不同配方精子保存液對精子的活力、授精能力都會產(chǎn)生很大影響，并直接影響人工繁殖的受精率。由表2可知，在黃顙魚親本雌雄尾數(shù)比為50 ∶ 1條件下，采用精子保存液A、B、C組的人工繁殖受精率差異不顯著，其平均受精率分別為82 7%、84 6%、80 4%。在黃顙魚親本雌雄尾數(shù)比為250 ∶ 1條件下，采用精子保存液A、B進(jìn)行人工繁殖的平均受精率分別為85 3%、82 8%，顯著高于保存液C組，A組與C組及B組與C組之間存在極顯著差異，A組與B組之間不存在顯著差異。由此可知，隨著黃顙魚親本雌雄比例的提高，3種精子保存液在黃顙魚繁殖中的應(yīng)用效果存在差別，保存液A、B的應(yīng)用效果明顯好于保存液C，保存液A的應(yīng)用效果最好。

2 2 保存液A在黃顙魚不同雌雄配組比例下的授精結(jié)果

應(yīng)用保存液A進(jìn)行全人工繁殖1 5 h，在黃顙魚親魚雌雄尾數(shù)比分別為50 ∶ 1、250 ∶ 1、500 ∶ 1條件下，3個(gè)比例組之間的受精率不存在顯著差異，平均受精率分別為81 1%、80 2%、78 4%。由此可見，提高雌雄配組授精的比例并未對受精率造成顯著影響，在應(yīng)用保存液A的情況下，單尾發(fā)育良好的黃顙魚雄魚（精巢質(zhì)量≥2 mg）可與500尾雌魚配組繁殖授精。

2 3 常溫保存條件下受精率隨時(shí)間的變化情況

圖1顯示，黃顙魚規(guī)?；敝尺^程中，常溫保存條件下，應(yīng)用保存液A、B黃顙魚受精率在1 5 h 內(nèi)變化趨勢不明顯，1 5～2 5 h之間均出現(xiàn)明顯的下降趨勢。應(yīng)用保存液A進(jìn)行繁殖時(shí)，0 5、2 5 h的受精率分別為83 72%、76 63%；應(yīng)用保存液B進(jìn)行繁殖時(shí)，0 5、2 5 h受精率分別為81 05%、71 67%。

2 4 保存液A在規(guī)?；敝持械膽?yīng)用效果

黃顙魚規(guī)?；敝尺^程中，由于雄魚精巢大小不一，質(zhì)量一般為1 2～2 6 g，所以親本魚雌雄配組的比例須根據(jù)實(shí)際情況確定。由表3可知，應(yīng)用精子保存液A，人工催產(chǎn)黃顙魚.

3 結(jié)論與討論

3 1 不同保存液對黃顙魚精子授精效果的影響

研究表明，黃顙魚繁殖過程中，受精率受精子質(zhì)量、卵子質(zhì)量、精子與卵子的比例及繁殖環(huán)境等因素影響。不同的保存液配方在黃顙魚精子的保存時(shí)間、活力及授精效果等方面具有較大差異 [8]。本試驗(yàn)保存液pH值范圍為6～8，均為由Na、K等鹽類組成的弱酸堿溶液，可保護(hù)精子 [8-9]。保存液A與B成分相似，授精效果相近，A液略優(yōu)于B液。保存液C成分過于簡單，且pH值略偏小，保存后精子活力及數(shù)量下降，故在提高雌雄比的情況下，授精效果相對較差。由于不同雌魚之間的卵子質(zhì)量、數(shù)量及成熟程度等均不一致，對人工授精效果影響很大，需要將雌魚所采的卵子充分均勻混合，再分組稱量，保證各試驗(yàn)組所采用魚卵質(zhì)量一致。

3 2 不同雌雄配組比例對人工授精效果的影響

由于黃顙魚在人工繁殖中需要?dú)⑿廴【虼嗽诒ＷC受精率的情況下，提高雌雄配組比例可節(jié)省親魚資源，有效提高雄魚使用效率及繁苗效率。保存液常溫保存條件下24 h內(nèi)可使80%以上的黃顙魚精子保持較好的活性 [10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用保存液A，將單尾黃顙魚雄魚配組繁殖的雌魚數(shù)量從50尾提高到250、500尾，受精率均未出現(xiàn)大幅度下降，且差異性不顯著。由此表明，單尾雄魚的精子經(jīng)保存液A有效保存后，精子的活力及數(shù)量未出現(xiàn)顯著下降，可基本滿足500尾雌魚卵子的授精需要。黃顙魚規(guī)?；敝尺^程中，單尾雄魚精巢質(zhì)量及所含精子數(shù)量具有明顯差異，因此當(dāng)所選雄魚精巢所含精子數(shù)量超過本試驗(yàn)魚精巢（2 mg）的精子數(shù)量時(shí)，雌雄配組繁殖比例可提高至更高的水平。

3 3 常溫保存條件下時(shí)間對人工授精效果的影響

丁淑荃等研究表明，室溫下，黃顙魚精子在保存液中保存4 h后，精子活力仍很強(qiáng)，被激活后幾乎100%精子在作快速運(yùn)動，授精能力未受到影響 [10]。本試驗(yàn)應(yīng)用保存液A、B常溫保存精子，2 5 h內(nèi)受精率下降，表明保存時(shí)間對人工授精的效果造成了一定影響，因而建議單批次繁苗授精時(shí)間控制在1 5 h內(nèi)。本試驗(yàn)單批次的親本量均在150 kg以上，人工催產(chǎn)時(shí)間較長，操作人員較多，導(dǎo)致雌魚性成熟時(shí)間不完全一致，人工擠卵過程發(fā)現(xiàn)有部分卵過熟的情況，后期更為明顯，這也是造成受精率下降的主要原因。

3 4 精子保存方法的應(yīng)用

黃顙魚采用常規(guī)方法繁殖時(shí)，單尾黃顙魚雄魚通常與 15～30 尾配組授精，繁殖成本較高，效率較低 [1-2]。本試驗(yàn)應(yīng)用精子保存方法，單尾黃顙魚雄魚配組雌魚質(zhì)量達(dá)32 2 kg， 尾數(shù)達(dá)320余尾（約0 1 kg/尾），雄魚親本的部分精巢較小，如果全部選用發(fā)育較好的雄魚，雌魚數(shù)量可提高至500尾以上。本方法大大提升了雄魚的使用效率，節(jié)約了雄魚親本資源，同

時(shí)減少繁苗勞動量，降低生產(chǎn)成本。

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