李福記，吳華裕，韓煥欽，陳鳳平，覃霞，呂宇，林有坤，舒艷，張偉峰，方玲，胡啟平，袁志剛，舒?zhèn)?/p>

廣西漢族早老癥家系三例病例研究
——線粒體DNA D－環(huán)區(qū)突變分析

李福記，吳華裕，韓煥欽，陳鳳平，覃霞，呂宇，林有坤，舒艷，張偉峰，方玲，胡啟平，袁志剛，舒?zhèn)?/p>

目的探討廣西漢族1個早老癥家系中3例兒童早老癥(HGPS)患者線粒體DNA D－環(huán)區(qū)(D－loop區(qū))突變是否呈現(xiàn)年齡相關(guān)的突變累積。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對3例HGPS患者及其父母、8例正常老人(正常老人組)的線粒體DNA D－loop區(qū)進(jìn)行擴增、測序。結(jié)果正常老年人線粒體DNA D－loop區(qū)較Cambridge序列存在較多的突變位點，HGPS患者與正常老人組線粒體DNA D－loop區(qū)突變率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);3例HGPS患者線粒體DNA D－loop區(qū)單體型與其母親一致;未檢測到3例HGPS患者線粒體DNA D－loop區(qū)發(fā)生新突變，也未檢測到3例HGPS患者線粒體DNA D－loop區(qū)存在差異。結(jié)論該家系3例HGPS患者在7歲前未發(fā)生線粒體DNA D－loop突變累積，且不同年齡患者均未見年齡相關(guān)的突變累積，推論線粒體DNA突變不是該家系HGPS患者加速衰老的重要原因。

衰老，過早;早老癥;DNA，線粒體;D－loop區(qū);突變

李福記，吳華裕，韓煥欽，等．廣西漢族早老癥家系三例病例研究——線粒體DNA D－環(huán)區(qū)突變分析［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(29):3624－3627．［www.chinagp.net］

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早老癥(HGPS)患者一般在1歲左右就顯示出皮膚硬化等病癥，3歲左右可見明顯的衰老表型(禿頂、皮膚色素沉著、典型小頜等)，臨床特征包括衰老面容、皮下脂肪缺失和骨質(zhì)疏松等［1－2］。HGPS是由于編碼A/C型核纖層蛋白(lamin A)的LMNA基因發(fā)生點突變而引起［3－5］，LMNA基因突變引起衰老的分子機制有待進(jìn)一步研究。人類線粒體DNA (mtDNA)全長16 569 bp，無內(nèi)含子，唯一的非編碼區(qū)是長為1 122 bp的D－環(huán)區(qū)(D－loop區(qū))。mtDNA的H鏈和L鏈復(fù)制起始點均位于此區(qū)內(nèi)，D－loop區(qū)調(diào)控著mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［6］。多項研究表明，mtDNA突變與衰老及其相關(guān)的退行性疾病、惡性腫瘤等相關(guān)［7－13］。mtDNA發(fā)生突變頻率最高的是D－loop區(qū)，而D－loop區(qū)又分為高突變區(qū)Ⅰ(HVRⅠ，mtDNA16024～16383)、高突變區(qū)Ⅱ(HVRⅡ，mtDNA57～372)和高突變區(qū)Ⅲ(HVRⅢ，mtDNA438～576)。HGPS被認(rèn)為是研究正常衰老進(jìn)程的一個特殊模型，已經(jīng)初步認(rèn)識到HGPS與人類生理性衰老有著類似的分子機制，HGPS放大了生理性衰老的過程。本研究通過檢測早老癥患者外周血mtDNA D－loop區(qū)的突變情況，探究早老癥患者是否如正常老年人一樣存在mtDNA突變及年齡相關(guān)的突變積累，為解釋早老癥的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料3例HGPS患者來自廣西賀州漢族一家系，2013年曾就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，同年其父母陪同3例HGPS患者到廣西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室進(jìn)行該病的遺傳咨詢，在征得家屬及患者的同意下取其家系所有成員(3例患者及其父母)外周血4 ml(EDTA抗凝，－20℃保存)進(jìn)行基因診斷及該病的其他研究，并簽訂了知情同意書;8例正常老人(正常老人組，年齡80～90歲，男3例、女5例)外周血4 ml(EDTA抗凝，－20℃保存)來自廣西百色平果縣。

1.2 基因組DNA的提取和PCR擴增及測序取3例HGPS患者及其父母、正常老人組凍存外周血樣本用酚氯仿法抽提全基因組DNA，用Nanodrop 2000測DNA濃度和質(zhì)量，于－20℃保存?zhèn)溆?。在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中查找Cambridge標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_012920.1)，用NCBI數(shù)據(jù)庫的Primer－blast功能(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/ tools/primer－blast/)在線設(shè)計引物，擴增片段長度為1 271 bp，含D－loop區(qū)全部序列，上游引物5'－CCAGTCTTGTAAACCGGAGATG－3';下游引物5'－TTCAGTGTATTGCTTTGAGGAGGT－3'。PCR反應(yīng)體系為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s，58℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，共40個循環(huán);72℃后延伸8 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗證成功后送往北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行單向測序，擴增產(chǎn)物測序所用引物為5'－CCAGTCTTGTAAACCGGAGATG－3'和5'－TAAATAGCCCACACGTTCCCC－3'。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析3例HGPS患者及其父母、正常老人組mtDNA D－loop區(qū)的測序結(jié)果(SEQ格式)采用DNAMAP軟件與GeneBank中的Cambridge標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_012920.1)進(jìn)行比對，并結(jié)合測序峰圖統(tǒng)計突變位點。采用SPSS 16.0軟件對早老癥患者組與正常老人組mtDNA D－loop區(qū)突變率進(jìn)行獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGPS患者的基本情況該家系于2009年就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，3例HGPS患者基本情況和臨床特征見表1?；蛟\斷結(jié)果顯示3例HGPS患者的突變位點均為LMNA R527C/R527C，發(fā)病年齡均在出生后6個月，均表現(xiàn)為血小板計數(shù)升高。

2.2 D－loop區(qū)的PCR擴增結(jié)果和測序結(jié)果成功擴增全部受試者外周血線粒體DNA D－loop區(qū)片段;成功測序全部受試者mtDNA D－loop區(qū)，先證者部分測序結(jié)果見圖1。

圖1 HGPS家系先證者mtDNA D－loop區(qū)測序結(jié)果Figure1 Sequencing resultsof themtDNA D－loop region of the propositus of the HGPS family

2.3 mtDNA D－loop區(qū)的突變情況3例HGPS患者的mtDNA D－loop區(qū)序列與其母親相同，mtDNA D－loop區(qū)單體型與其母親一致，與其父親有8個不同的位點(見表2)。未檢測到3例HGPS患者mtDNA D－loop區(qū)新發(fā)生的突變，也未檢測到3例HGPS患者mtDNA D－loop區(qū)存在差異(見表2)。

測序結(jié)果顯示正常老年人組mtDNA D－loop區(qū)較Cambridge標(biāo)準(zhǔn)序列存在較多的突變位點(見表2)，HGPS患者mtDNA D－loop區(qū)的突變率均為0.62%，正常老人組mtDNA D－loop區(qū)的突變率均大于0.70%，兩組mtDNA D－loop區(qū)突變率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－2.48，P=0.034，見表3)。

表1 3例HGPS患者的基本情況和臨床特征Table 1 Basic information and clinical features of the three HGPSpatients

表2 HGPS家系與正常老人組mtDNA D－loop區(qū)突變結(jié)果Table 2 Statistic result of themtDNA D－loop region of the HGPS family and the normal seniors

表3 HGPS患者與正常老人突變率比較Table3 Comparison ofmutation rate between the three HGPScasesand the normal elders

正常老年人組mtDNA D－loop區(qū)共75個突變位點，其中30個(40.0%)位于HVRⅠ，35個(46.7%)位于HVRⅡ，3個(4.0%)位于HVRⅢ，7個(9.3%)位于非高突變區(qū)(NoHVR)。

3 討論

本研究報道了廣西地區(qū)3例HGPS患者，并對其mtDNA D－loop區(qū)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示該家系HGPS患者mtDNA D－loop區(qū)沒有發(fā)生突變，且不同年齡患者間未見年齡相關(guān)的突變累積。提示mtDNA的突變積累不一定是導(dǎo)致HGPS患者細(xì)胞加速衰老的重要原因，提示mtDNA突變可能是細(xì)胞衰老過程中(可能主要是衰老后期)由于基因組不穩(wěn)定性增加而導(dǎo)致的結(jié)果。

HGPS患者mtDNA D－loop區(qū)的分析未見文獻(xiàn)報道。本研究采用mtDNA和progeria為關(guān)鍵詞檢索不到關(guān)于HGPS患者mtDNA D－loop區(qū)突變的研究報告。但關(guān)于mtDNA突變與衰老的相關(guān)性卻有大量文獻(xiàn)報道，其因果關(guān)系存在較大爭議［14－15］。Michikawa等［11］對人成纖維細(xì)胞mtDNA D－loop區(qū)的突變研究發(fā)現(xiàn)老年人中出現(xiàn)mtDNA突變的累積，其中T414G具有年齡相關(guān)性;Wang等［13］對肌肉組織中mtDNA D－loop區(qū)的突變研究中也發(fā)現(xiàn)了老年個體中存在大量的點突變; Theves等［12］對肌肉組織和口腔細(xì)胞mtDNA D－loop區(qū)的研究也得出了相同結(jié)論。以上研究結(jié)果提示mtDNA突變導(dǎo)致功能喪失和能量代謝障礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老，推論mtDNA突變可能是衰老的一個重要原因。Rivera－Torres等［16］對健康和HGPS患者纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，HGPS患者纖維細(xì)胞存在早老蛋白的累積，線粒體出現(xiàn)功能障礙，線粒體氧化磷酸化相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。此外，在有早老蛋白累積的LMNAG609G/ G609G突變小鼠和金屬蛋白酶Zmpste24－/－缺失小鼠的纖維細(xì)胞中同樣也發(fā)現(xiàn)了線粒體功能障礙。認(rèn)為線粒體功能障礙加速了HGPS患者器官的衰退和老化。提示早老蛋白的累積可能影響線粒體氧化呼吸相關(guān)的基因表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，誘發(fā)細(xì)胞衰老。Trifunovic等［17］通過基因敲除技術(shù)改變小鼠POLG1基因的第3個外顯子，使催化亞基polγA核酸外切酶活性結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變，導(dǎo)致聚合酶γ的核酸外切活性喪失，使mtDNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯配無法修復(fù)，結(jié)果檢測到這些突變的老鼠出現(xiàn)了大量的mtDNA的點突變和缺失;且存在突變的老鼠出現(xiàn)了與HGPS相關(guān)的表型，如駝背、禿頭、骨質(zhì)疏松、體質(zhì)量下降、身體脂肪量及肌肉量下降和心肌肥大等。這個研究結(jié)果進(jìn)一步證實mtDNA突變導(dǎo)致線粒體功能喪失是細(xì)胞和機體衰老的重要原因。本研究顯示LMNA R527C/R527C突變型的HGPS患者發(fā)病早中期并未發(fā)現(xiàn)mtDNA D－loop區(qū)存在突變，同時也未發(fā)現(xiàn)隨著年齡增加的突變累積;因此推測LMNA的R527C突變并不一定通過增加mtDNA的突變來作為主要原因加速衰老過程。

mtDNA發(fā)生高頻率的突變主要是由于:(1)mtDNA分子上為核苷酸結(jié)合蛋白，缺少組蛋白的保護(hù);(2)mtDNA在復(fù)制時mtDNA聚合酶polγ的校讀功能差［18］;(3)mtDNA易受線粒體代謝過程中產(chǎn)生的活性氧的損傷［19］。本研究在檢測HGPS家系的同時，也設(shè)置了正常老年人作為對照，發(fā)現(xiàn)正常老年人存在突變積累，這與相關(guān)報道相符［9－11］。并且，正常老年人的突變集中分布于HVRⅠ、Ⅱ，這與其他mtDNA D－loop區(qū)的研究相符［20－21］。同時，檢測結(jié)果表明3例患者mtDNA D－loop區(qū)單體型與其母親一致，與其父親有8個不同的位點，與線粒體母系遺傳規(guī)律相符。廣西HGPS家系患者2和患者3均表現(xiàn)為禿頭、皮膚干燥、皮下脂肪缺乏等衰老的表型。然而，本研究在此2例HGPS患者中并沒有檢測到mtDNA D－loop區(qū)的突變，該HGPS家系3例患者7歲前的mtDNA D－loop區(qū)檢測沒有出現(xiàn)與年齡相關(guān)的突變累積。此結(jié)果提示，LMNA R527C/R527C突變型HGPS的發(fā)病前中期并未造成mtDNA的損傷，或者可能并未造成線粒體功能的明顯變化。線粒體功能障礙到底是衰老的原因還是結(jié)果，或者多大程度上可導(dǎo)致細(xì)胞加速衰老仍有待進(jìn)一步研究。HGPS可以作為一種生理衰老的研究模型，對其線粒體功能與衰老的相關(guān)性研究將加深認(rèn)識線粒體在衰老過程中的作用。

作者聲明:文章為原創(chuàng)作品，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，內(nèi)容不涉及泄密，無一稿兩投，無抄襲，無內(nèi)容剽竊，無作者署名爭議，無與他人課題以及專利技術(shù)的爭執(zhí)，內(nèi)容真實，文責(zé)自負(fù)。

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Study of Three Cases of Hutchinson－Gilford Progeria Syndrome in A Guangxi Han Fam ily:Analysis of M itochondrial DNA D－loop Region M utations

LI Fu－ji，WU Hua－yu，H
AN Huan－qin，et al．Department of Cell Biology and Genetics，GuangxiMedical University，Nanning 530021，China

Objective To investigate whether age－related mutation accumulation occurs in the mitochondrial DNA (mtDNA)D－loop region of three cases with Hutchinson－Gilford progeria syndrome(HGPS)in a Guangxi Han family．M ethods Polymerase chain reaction(PCR)was used to amplify themtDNA D－loop region of the three HGPS cases and their parents，as well as 8 normal seniors，and all the PCR products were sequenced and analyzed．Results The normal elders had moremutation sites in themtDNA D－loop region compared with Cambridge standard sequence，and the three HGPS cases and the normal elders were significantly different in themutation in themtDNA D－loop region(P＜0.05);the three HGPS cases had same haplotypewith theirmothers;no newmutationswere noted in themtDNA D－loop region of the three HGPS cases，and no differences were observed in the mtDNA D－loop region among the three HGPS cases．Conclusion No mutation accumulation was observed in themtDNA D－loop region of the three HGPS cases before they turned 7 years old，and no agerelated mutation accumulation was found in patients of differentage stages．Thismay lead to a conclusion thatmtDNAmutation is not amajor reason for the accelerated aging of the three HGPS patients in this family．

Aging，premature;Hutchinson－Gilford progeria syndrome;DNA，mitochondrial;D－loop;Mutation

R 441.9

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.29.027

2015－03－15;

2015－07－20)

(本文編輯:趙躍翠)

廣西自然科學(xué)青年基金資助項目(2013GXNSFBA019143);國家自然科學(xué)基金資助項目(81260479);廣西高校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目(201410598030)

530021廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室(李福記，吳華裕，陳鳳平，呂宇，方玲，胡啟平，袁志剛，舒?zhèn)?;廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染內(nèi)科(韓煥欽);廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科(覃霞，林有坤);浙江省湖州市婦幼保健院(舒艷，張偉峰)

舒?zhèn)ィ?30021廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室;E－mail:shuwei7866@126.com