張?zhí)K閩　湯曉樞　周媛媛（上海長(zhǎng)城藥業(yè)有限公司　上?！?01707）

腦蛋白水解物原料肽含量測(cè)定方法的改進(jìn)

張?zhí)K閩湯曉樞*周媛媛
（上海長(zhǎng)城藥業(yè)有限公司上海201707）

目的：優(yōu)化腦蛋白水解物原料肽含量測(cè)定方法。方法：采用Agilent Zorbax Eclipse-AAA色譜柱（4.6 mm×150 mm, 5 mm）, 流動(dòng)相A：0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.80）, 流動(dòng)相B：乙腈-甲醇-水（45∶45∶10）, 流速1.5 ml/min, 柱溫40 ℃, 檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm, 262 nm, 梯度洗脫。結(jié)果：各種氨基酸的濃度在15.0～120.0 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r＞0.999）, 各種氨基酸的平均回收率為98.1%～103.6%。結(jié)論：該方法快速、簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好, 結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 適用于腦蛋白水解物原料肽含量的測(cè)定。

腦蛋白水解物原料肽含量測(cè)定氨基酸高效液相色譜

腦蛋白水解物原料（國(guó)藥準(zhǔn)H31023028）為我們公司原料藥車(chē)間生產(chǎn)的原料藥，系健康豬的鮮大腦經(jīng)脫脂和水解而成。2013年6月28日國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布了《關(guān)于腦蛋白水解物原料國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的公示稿》，明確了需進(jìn)行腦蛋白水解物原料肽含量的測(cè)定，即需對(duì)腦蛋白水解物原料中游離及水解氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，并用于計(jì)算肽含量（肽含量=水解氨基酸含量-游離氨基酸含量）。

大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)紫外吸收，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物[1]。氨基酸HPLC柱前衍生化的分析方法有多種，以Waters AccQ·Tag衍生法[2-4]、OPA-FMOC（鄰苯二甲醛—9-芴甲基氯甲酸酯）衍生法測(cè)定氨基酸最為常用[5-7]。本公司曾用OPA-FMOC衍生法測(cè)定腦蛋白水解物原料中游離及水解氨基酸含量（色譜柱Hypersil ODS-C18：4.6 mm×100 mm，5 mm，流動(dòng)相A：pH 7.20的醋酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B：pH 7.20的醋酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇，梯度洗脫）。但我們發(fā)現(xiàn)該種色譜條件在分析檢測(cè)氨基酸時(shí)存在以下問(wèn)題：①在同時(shí)分離16種氨基酸時(shí)，部分氨基酸分離度差，系統(tǒng)適用性不佳；。②測(cè)定方法的重現(xiàn)性差；③進(jìn)行梯度洗脫的A、B相鹽濃度高，直接影響色譜柱的使用壽命；④該系統(tǒng)對(duì)pH較敏感，配制A、B相pH誤差會(huì)直接影響氨基酸的分離。本研究參考文獻(xiàn)優(yōu)化了腦蛋白水解物原料肽含量測(cè)定的方法[8]。

1　儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀，DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器（安捷倫科技中國(guó)有限公司）。Sartorius BP121S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。16種氨基酸對(duì)照品（批號(hào)：140624-200805，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。腦蛋白水解物原料（批號(hào)：20101102）為本公司產(chǎn)品。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸氫二鈉及其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Agilent Zorbax Eclipse-AAA色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 mm），流動(dòng)相為A：0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）(取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）6.24 g，加水1 000 ml溶解，用5 mol/L的氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至7.80±0.05)；流動(dòng)相B：乙腈-甲醇-水（45∶45∶10），按表1進(jìn)行梯度洗脫。柱溫：40 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm，262 nm。流速：1.5 ml/min.。

表1 梯度洗脫

2.216種氨基酸對(duì)照品溶液的配制

對(duì)照品溶液的制備：稱(chēng)取16種氨基酸對(duì)照品各約30 mg，至100 ml容量瓶中，以0.04 mol/L鹽酸溶液溶解至刻度（對(duì)照品貯備液），再精密量取2 ml，至10 ml容量瓶中用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3供試品溶液的配制

游離氨基酸含量測(cè)定供試品溶液：精密稱(chēng)重腦蛋白水解物原料300 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并超聲10 min，加水稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為游離氨基酸含量測(cè)定供試品溶液。

水解氨基酸含量測(cè)定供試品溶液：精密稱(chēng)取腦蛋白水解物原料200 mg，置硬質(zhì)安瓿中，加鹽酸2 ml，搖勻，充氮封口，于110 ℃水解20 h，放冷，啟封后溶液置蒸發(fā)皿中，水浴蒸發(fā)至干，加水使殘留物溶解并稀釋至100 ml，作為水解氨基酸含量測(cè)定供試品溶液。

2.4衍生化程序

采用Agilent液相色譜儀自帶的柱前衍生的方法，設(shè)定進(jìn)樣程序，對(duì)所得的氨基酸樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)，進(jìn)樣器程序設(shè)定見(jiàn)表2。

表2　衍生進(jìn)樣程序設(shè)定

氨基酸衍生試劑配制方法：

小瓶 1：8 mg/ml鄰苯二甲醛（OPA）溶液：精密稱(chēng)取80 mg鄰苯二甲醛（OPA），依次加入7 ml硼酸緩沖液溶液、1 ml乙腈和125 ml 巰基丙酸，搖勻并溶解，即得。

小瓶 2：5 mg/ml 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）溶液：精密稱(chēng)取50 mg 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC），用乙腈溶解并稀釋至10 ml，搖勻并溶解，即得。

小瓶 3：雙重蒸餾水。

小瓶 4：硼酸緩沖液：精密稱(chēng)取1.236 g硼酸至50 ml容量瓶中，加水超聲至全部溶解，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.2，即得。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取需測(cè)定的16種氨基酸的對(duì)照品：門(mén)冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、鹽酸賴(lài)氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，依法配制對(duì)照品溶液，衍生后進(jìn)樣，進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（圖1）。

圖1 色譜條件改進(jìn)前后16種氨基酸系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

從圖1A可見(jiàn)，在該色譜條件下，需測(cè)定的16種氨基酸均能完全分離，峰形佳，較圖1B中原色譜分離條件有了明顯的改善。分離度數(shù)據(jù)顯示（表3），改進(jìn)前16種氨基酸的分離度未完全達(dá)到藥典規(guī)定的分離度要求，纈氨酸與甲硫氨酸、亮氨酸與賴(lài)氨酸的分離度僅大于1.0，且甘氨酸與蘇氨酸未完全分離。經(jīng)色譜條件改進(jìn)優(yōu)化后各氨基酸的分離度均大于1.5，分離效果明顯改善，實(shí)現(xiàn)了16種氨基酸在同一色譜條件下的完全基線(xiàn)分離。

表3　16種氨基酸峰分離度

2.5.2線(xiàn)性范圍

分別取16種氨基酸對(duì)照品配制成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，分別取上述對(duì)照品溶液衍生后進(jìn)樣，并計(jì)算16種氨基酸的線(xiàn)性回歸方程（表4）。

表4　16種氨基酸線(xiàn)性試驗(yàn)

結(jié)果顯示，16種氨基酸的濃度在約15.0～120.0 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r＞0.999）。

2.5.3精密度試驗(yàn)

分別取16種氨基酸對(duì)照品溶液衍生后連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見(jiàn)表5。

連續(xù)進(jìn)樣6次16種氨基酸峰面積偏差的RSD均＜2.0%。可知該色譜條件下氨基酸測(cè)定方法的精密度較好。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品，依法制備游離氨基酸和水解氨基酸供試品溶液各6份，衍生后分別測(cè)定游離、水解氨基酸的含量，并分別計(jì)算腦蛋白水解物原料肽含量（表6）。

由表6結(jié)果可知：肽含量均值為419.5 mg/g，RSD小于2.0%，表明采用該方法測(cè)定腦蛋白水解物原料肽含量重復(fù)性較好，測(cè)定結(jié)果可靠。

2.5.5溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制備的游離氨基酸和水解氨基酸供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h衍生并進(jìn)樣檢測(cè)，以0 h進(jìn)樣樣品的含量為100%，比較供試品溶液中各氨基酸的日內(nèi)穩(wěn)定性(表7)。

表5　腦蛋白水解物原料肽含量測(cè)定精密度試驗(yàn)

表6　腦蛋白水解物原料肽含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)（mg/g）

表7　腦蛋白水解物原料供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)(%)

結(jié)果顯示，游離和水解供試品溶液中所含16種氨基酸在24 h內(nèi)的含量變化的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，含量測(cè)定結(jié)果可靠。

2.5.6加樣回收試驗(yàn)

取供試品適量，按照高（120%）、中（100%）、低（80%）三個(gè)濃度加入含16種氨基酸的對(duì)照品儲(chǔ)備液，依法制備加樣回收的供試品溶液，每個(gè)濃度各3份。取上述加樣溶液衍生后進(jìn)樣，并計(jì)算加樣回收率(表8)。

結(jié)果表明，游離、水解氨基酸含量測(cè)定中16種氨基酸的回收率均在98.1%～103.6%范圍內(nèi)，RSD均小于2.0%，證明本方法回收率結(jié)果良好。

2.6樣品測(cè)定

取不同批次的腦蛋白水解物原料，依法制備游離、水解供試品溶液，并衍生化進(jìn)樣。測(cè)定并計(jì)算肽含量（表9）。

表8　腦蛋白水解物原料肽含量測(cè)定加樣回收試驗(yàn)(%)

表9　腦蛋白水解物肽含量測(cè)定（mg/g）

3　討論

3.1檢測(cè)器的選擇

OPA-FMOC衍生法測(cè)定氨基酸，其中一級(jí)氨基酸（Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Val、Met、Trp、Ile、Phe、Leu、Lys共15種）首先與OPA反應(yīng)，形成OPA-氨基酸，在338 nm下有最大吸收。二級(jí)氨基酸（Pro）則與FMOC衍生生成FMOC-氨基酸，在262 nm下有最大吸收。因加入吲哚與3-巰基丙酸相結(jié)合降低了氨基酸的疏水性，所以O(shè)PA衍生化產(chǎn)物較FMOC衍生化產(chǎn)物色譜出峰時(shí)間較早。

在原有方法中，我們選用VWD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，并在一級(jí)氨基酸中最后出峰的鹽酸賴(lài)氨酸(Lys)出峰后設(shè)置一個(gè)波長(zhǎng)切換，檢測(cè)波長(zhǎng)由338 nm切換至262 nm，用于檢測(cè)二級(jí)氨基酸的脯氨酸(Pro)。該方法對(duì)使用的紫外檢測(cè)器要求不高，但因波長(zhǎng)切換導(dǎo)致檢測(cè)器的急速光柵變化，脯氨酸(Pro)出峰時(shí)檢測(cè)器未必達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，且在波長(zhǎng)切換時(shí)如基線(xiàn)發(fā)生抖動(dòng)，會(huì)在圖譜上形成一個(gè)較大的上升、下降平臺(tái)，使得262 nm下脯氨酸檢測(cè)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。故我們建議采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行兩級(jí)氨基酸的檢測(cè)，即分別連續(xù)收集338 nm和262 nm兩個(gè)波長(zhǎng)的信號(hào)，這樣保證了一級(jí)、二級(jí)氨基酸同時(shí)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.2參比波長(zhǎng)的設(shè)定

在A(yíng)gilent Zorbax Eclipse-AAA色譜柱說(shuō)明書(shū)中，明確規(guī)定了氨基酸檢測(cè)參比波長(zhǎng)的設(shè)定，參比波長(zhǎng)的設(shè)定參數(shù)如下：338 nm：10 nm帶寬（bw），參比波長(zhǎng)：390 nm，20 nm帶寬（bw）（適用于OPA-氨基酸）；262 nm：16 nm帶寬（bw），參比波長(zhǎng)：324 nm，8 nm帶寬（bw）（適用于FMOC-氨基酸）。峰寬：＞0.03 min（0.5 s）。狹縫間距：4 nm。

在方法優(yōu)化過(guò)程中我們進(jìn)行了相關(guān)比對(duì)試驗(yàn)，對(duì)比了其與工作站默認(rèn)參比波長(zhǎng)設(shè)置的區(qū)別，結(jié)果顯示采用這種參比波長(zhǎng)的設(shè)定，對(duì)于氨基酸檢測(cè)的圖譜起到了明顯的優(yōu)化作用，設(shè)定后梯度洗脫條件下色譜圖的基線(xiàn)較未設(shè)定前更平穩(wěn)，不再有明顯漂移。各氨基酸峰的對(duì)稱(chēng)性也有改善，峰型更佳。從而提高了多種氨基酸含量測(cè)定的準(zhǔn)確性（圖2）。

圖2　參比波長(zhǎng)優(yōu)化前后16種氨基酸的分析圖譜

3.3流動(dòng)相的改進(jìn)

原方法中使用的流動(dòng)相存在以下問(wèn)題：①流動(dòng)相A為pH 7.20的醋酸鹽緩沖液，流動(dòng)相B為pH 7.20的醋酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇，兩相均為較高濃度的鹽溶液，對(duì)色譜柱、液相泵的使用壽命影響較大；②流動(dòng)相B為鹽溶液與有機(jī)溶劑的混合溶液，該混合溶液為不穩(wěn)定體系，在分析過(guò)程中可能會(huì)有鹽析出，影響氨基酸的分離；③該系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)相pH非常敏感，要求我們配制A、B相的pH誤差范圍應(yīng)為7.20±0.05，如有誤差則會(huì)影響各氨基酸的分離度。

改進(jìn)后的色譜條件A相為一定濃度的磷酸鹽溶液，B相則為不含鹽的乙腈、甲醇、水的混合液，降低了對(duì)色譜柱、液相泵的損耗。且該系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)相的pH敏感性較低，pH的誤差對(duì)氨基酸分離的影響不大，也大大提高了流動(dòng)相配制的便捷性。

3.4鹽酸對(duì)于色譜柱的損耗

色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸為疏水氨基酸，均難溶于水，在原有操作規(guī)程中我們采用0.04 mol/L鹽酸溶液作為溶劑配制對(duì)照品溶液。在大量的試驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)鹽酸對(duì)于色譜柱存在損耗，使得色譜柱柱效下降，壽命縮短。故我們改進(jìn)了對(duì)照品溶液的配制方式。先將以上氨基酸配制為高濃度的對(duì)照品貯備液（配制濃度為測(cè)試濃度的5倍，溶劑為0.04 mol/L鹽酸溶液），使其完全溶解，再使用雙蒸水稀釋至合適濃度，這種配制方式大大降低了對(duì)照品溶液中鹽酸的濃度，更好的保護(hù)了色譜柱。

在水解氨基酸樣品前處理時(shí)，我們需將腦蛋白水解物原料用濃鹽酸水解后制備供試樣品溶液。在處理過(guò)程中我們將酸水解后的樣品水浴蒸干，再使用雙蒸水溶解并稀釋。這一過(guò)程的目的同樣是將供試品中的鹽酸盡可能去除，起到保護(hù)色譜柱的作用。

4　結(jié)論

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本研究所建立的肽含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)，能準(zhǔn)確測(cè)定腦蛋白水解物原料中肽的含量。

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Optimization of a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate

ZHANG Sumin, TANG Xiaoshu*, ZHOU Yuanyuan
(Shanghai Greatwall Pharmaceutical CO. LTD., Shanghai 201206, China)

Objective: To optimize a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate. Methods: HPLC was performed on an Agilent Zorbax Eclipse-AAA column（4.6 mm×150 mm, 5 mm）with mobile phase A: 0.04 mol/L phosphate buffer (pH 7.8) and mobile phase B: acetonitrile-methanol-water (45：45：10) at UV detection wavelength of 338 nm and 262 nm, flow rate of 1.5 ml/min (gradient elution) and column temperature of 40 ℃. Results: The standard curve of every amino acid was linear over the range of 15.0~120.0 mg/ml (r＞0.999）with average recovery 98.1%~103.6%. Conclusion: This method is simple, accurate, sensitive and reproducible, and can be applied in the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate.

cerebroprotein hydrolysate; determination of peptide content; amino acids; HPLC

R927.2; O657.72

A

1006-1533(2015)13-0074-06

湯曉樞(1979-), 男, 工程師, 從事化學(xué)與生化藥品研發(fā)工作。E-mail: tangxiaoshu_1979@126. com

2015-03-03)