任彥鋒 費(fèi)瑞 馬佳男 劉志強(qiáng) 王霞 費(fèi)瑜

水溶性殼聚糖對缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護(hù)作用

任彥鋒 費(fèi)瑞 馬佳男 劉志強(qiáng) 王霞 費(fèi)瑜

目的 探討水溶性殼聚糖（WSC）對缺血再灌注損傷（IRI）大鼠心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制，為藥物防治心肌IRI提供實驗依據(jù)。方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IRI模型組、低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組，每組 12只。其中，IRI模型組和各劑量WSC組大鼠用開胸直視下結(jié)扎左冠狀動脈前室間支法建立大鼠IRI模型，假手術(shù)組大鼠僅分離而不結(jié)扎左冠狀動脈前室間支。假手術(shù)組和IRI模型組給予生理鹽水10 ml/kg。低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組分別給予WSC 120 mg/kg、180 mg/kg和240 mg/kg，每日灌胃一次，15 d后處死大鼠。心臟取血，分離血清，用ELSIA法檢測血清中SOD和MDA水平。在靠近心尖部1/3處平行于房室溝橫行切取新鮮心肌組織塊，固定后石蠟包埋。用HE染色法觀察心肌組織形態(tài)變化。RT-PCR檢測心肌組織中UCP2 mRNA表達(dá)。結(jié)果 光鏡下觀察，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核染色清晰，心肌間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤；IRI模型組大鼠心肌纖維紊亂，界線不清，胞漿淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細(xì)胞浸潤，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死；WSC干預(yù)組肌纖維偶有斷裂、融解現(xiàn)象，少量心肌細(xì)胞顆粒變性、水腫，偶見炎性細(xì)胞浸潤。與假手術(shù)組相比，IRI模型組SOD水平明顯下降，而MDA水平和心肌組織中UCP2 mRNA表達(dá)均明顯升高（P<0.01）；與IRI模型組比較，低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組SOD水平顯著提高，MDA水平和心肌組織中UCP2 mRNA表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 WSC可逆轉(zhuǎn)心肌IRI，對IRI大鼠心肌具有保護(hù)作用。這種作用可能與對抗IRI時氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

水溶性殼聚糖；超氧化物歧化酶；丙二醛；解耦聯(lián)蛋白2

研究表明，心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有極其密切的關(guān)系。藥物可通過對抗氧化應(yīng)激來防止心肌IRI[1-3]。水溶性殼聚糖（water-soluble chitosan，WSC）是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，具有抗氧化等作用[4]。但目前有關(guān)WSC能否防治心肌IRI的文獻(xiàn)報道甚少。為此本研究制作大鼠心肌IRI模型，并用WSC進(jìn)行干預(yù)，旨在探討WSC對IRI大鼠心肌的作用及機(jī)制，為藥物防治心肌IRI提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性SD大鼠，清潔級，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物中心提供［動物合作證號SCXX（吉）2010-0005］，體重（250±10）g。飼養(yǎng)條件：室溫 18℃～25℃，相對濕度 40%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。所有大鼠實驗前在室內(nèi)給予標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)2 d，實驗前稱重，禁食12 h。

UltraCutE超薄切片機(jī)（奧地利衛(wèi)永儀器公司），顯微鏡（日本JEOL公司），酶標(biāo)測定儀（日本MODEL550），小動物人工呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），PCR儀（美國PE公司），凝膠分析儀（杭州天能生物科技有限公司），WSC（青島海普生物技術(shù)有限公司，溶解度為125，脫乙酰度54.73%），大鼠SOD、MDA試劑盒（北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司），M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金有限公司），UCP-2和β-actin的基因引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）。大鼠UCP2擴(kuò)增片段長度為 472 bp（上游引物：5′-GCAGTTCTACACCAAGGGCT-3′；下 游 引 物 ：5′-AGCATG －GTCAGGGCACAGTG-3′），β-actin 擴(kuò)增片段長度為690 bp（上游引物：5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAG GCC-3′；下游引物：5′-CCACACAGATGACTT GCGCTC AGG-3′）。

1.2 實驗方法 按文獻(xiàn)報道方法建模：大鼠麻醉，仰臥固定手術(shù)臺上，連接小動物人工呼吸機(jī)和心電圖機(jī)。剪開心包膜，暴露心臟，左手拇、食指輕壓胸廓把心臟擠出，于左心耳下方2 mm處，用10/0號無損傷縫合針穿線，進(jìn)針深度為1.5～2.0 mm，寬為2～3 mm，適應(yīng)5 min，在縫合線與左冠狀動脈前室間支血管間墊一細(xì)小塑料管（直徑約1.0 mm），結(jié)扎時用活結(jié)結(jié)扎。同步觀察心電圖變化，當(dāng)出現(xiàn)ST段抬高與高聳T波融合呈弓背向上單向曲線，為左室游離壁缺血成功的標(biāo)志。結(jié)扎30 min后剪去膠管使缺血再灌通，再灌通時間為120 min。再通后心電圖形表現(xiàn)為缺血圖形減輕或出現(xiàn)病理性Q波，當(dāng)抬高的ST段下降1/2以上，以此圖形作為心肌IRI標(biāo)準(zhǔn)，符合標(biāo)準(zhǔn)者即為心肌IRI造模成功并入選實驗。假手術(shù)組僅分離左冠狀動脈前室間支，穿線但不結(jié)扎。

將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IRI模型組、低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組，每組12只。假手術(shù)組和IRI模型組分別給予生理鹽水10 ml/kg，低劑量WSC、中劑量WSC和高劑量WSC組分別給予WSC 120 mg/kg、180 mg/kg和240 mg/kg，每日灌胃一次，連續(xù)15 d。各組分別于實驗結(jié)束后處死大鼠，心臟取血，分離血清，用ELSIA法檢測血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。在靠近心尖部1/3處平行于房室溝橫行切取新鮮心肌組織塊，一部分放入4%多聚甲醛溶液，固定 24 h，石蠟包埋，用HE染色法觀察心肌組織形態(tài)變化。另一部分心肌組織剪成小塊，勻漿后加入1 ml Trizol，在冰上研磨2～3次；加入氯仿200 ml，用力振蕩，吸取上清液（內(nèi)含核酸）；用RT-PCR檢測心肌組織中UCP2 mRNA表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，樣本均數(shù)間成對比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核染色清晰，心肌間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤。IRI模型組大鼠心肌纖維紊亂，界線不清，胞漿淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細(xì)胞浸潤，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死。WSC干預(yù)組肌纖維偶有斷裂、融解現(xiàn)象，少量心肌細(xì)胞顆粒變性、水腫，偶見炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 WSC對IRI大鼠血清SOD和MDA水平的影響 與假手術(shù)組相比，IRI模型組大鼠SOD水平下降，而MDA水平明顯升高（P＜0.01）。與IRI模型組比較，低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組大鼠SOD水平顯著提高，MDA水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠血清SOD和MDA水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清SOD和MDA水平比較（±s）

注：SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與IRI模型組比較，bP<0.05，cP<0.01

組別 SOD（U/L） MDA（nmol/L）假手術(shù)組 231.53±10.39 2.95±0.85 IRI模型組 163.21±7.14a5.55±0.26a低劑量 WSC 組 183.16±8.58b3.98±0.26b中劑量 WSC 組 189.64±10.40b3.61±0.25b高劑量 WSC 組 198.52±11.04c3.33±0.23c

2.3 WSC對心肌IRI大鼠心肌組織UCP2 mRNA表達(dá)的影響 IRI模型組心肌組織中UCP2 mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組大鼠心肌組織中UCP2 mRNA表達(dá)均明顯低于IRI模型組（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 2。

3 討論

SOD是機(jī)體內(nèi)清除活性氧簇的一種金屬酶，能使生物體內(nèi)過氧化物轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧，其活性的高低可間接反映體內(nèi)自由基的濃度。MDA是膜脂質(zhì)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，是反映氧化損傷的指標(biāo)。UCP2是一種鑲嵌在線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子載體蛋白，生理狀態(tài)下，當(dāng)機(jī)體受到寒冷、ROS和高葡萄糖等刺激后，線粒體UCP2的轉(zhuǎn)錄和翻譯增加，使線粒體內(nèi)膜電子流動加快，線粒體膜電勢降低，進(jìn)而發(fā)揮其解耦聯(lián)作用，因此，UCP2又被稱為內(nèi)源性抗氧化蛋白。已有報道IRI時大鼠心肌纖維紊亂，界線不清，胞漿淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細(xì)胞浸潤，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死，血清 SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，心肌UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)增加，且與CK活性、MDA含量、SOD活性有一定的相關(guān)性[1-3,5]。還有報道UCP2在缺血后表達(dá)增多，再灌注1 h后UCP2表達(dá)更豐富，UCP2表達(dá)增加是心肌對IRI的一種適應(yīng)性反應(yīng)，并對IRI心肌有保護(hù)作用[6]。本實驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，進(jìn)一步證實氧化應(yīng)激參與心肌IRI病理過程的結(jié)論。

IRI時由于黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)、線粒體單電子還原增多、兒茶酚胺自氧化增強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等因素使活性氧簇增多，過多的活性氧簇對SOD的直接損傷和SOD的大量消耗，使得SOD活性降低，清除活性氧簇能力下降，進(jìn)而激活內(nèi)源性抗氧化蛋白-UCP2，UCP2 mRNA表達(dá)增加不僅能抑制活性氧簇的產(chǎn)生和細(xì)胞炎癥反應(yīng)，還能增強(qiáng)線粒體內(nèi)鈣離子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而避免細(xì)胞內(nèi)鈣的蓄積，防止鈣超載引起的細(xì)胞凋亡[7]，所以心肌IRI時UCP2 mRNA表達(dá)增加對心肌有一定的保護(hù)作用。

WSC是殼聚糖脫乙酰反應(yīng)的產(chǎn)物，具有不形成結(jié)晶、流變性和較高的水溶性等特點，因而它獨(dú)特的生理活性和物化性質(zhì)更容易得到體現(xiàn)。Hou等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，WSC能促進(jìn)成骨細(xì)胞功能，如堿性磷酸酶活動、細(xì)胞生存能力和礦化，這一過程是通過抗氧化活性進(jìn)而減少或防止成骨細(xì)胞變性來實現(xiàn)的。Safari等[5]發(fā)現(xiàn)，氯沙坦可以降低心肌IRI中UCP2 mRNA的表達(dá)，可對缺血的心肌起保護(hù)作用。周曦等[8]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能抑制UCP2的表達(dá)，進(jìn)而削弱細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的生成，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。趙東明等[9]發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以下調(diào)心肌梗死后心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)水平，從而改善心衰心室重構(gòu)過程中能量代謝。本實驗發(fā)現(xiàn)，WSC能改善IRI時造成的心肌組織形態(tài)學(xué)改變，同時能使SOD水平升高，MDA水平和心肌UCP2 mRNA的表達(dá)明顯下降，與多數(shù)學(xué)者報道一致，說明WSC逆轉(zhuǎn)心肌IRI，對IRI大鼠心肌具有保護(hù)作用。這種作用可能與對抗IRI時氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

WSC的分子結(jié)構(gòu)含有2個羥基和2個氨基，它們能與自由基結(jié)合[10]，使活性氧簇下降，SOD的功能得以恢復(fù)，當(dāng)氧化應(yīng)激消除或者減輕后，UCP2 mRNA的表達(dá)自然會下降。線粒體主要功能是給機(jī)體提供能量，當(dāng)三羧循環(huán)產(chǎn)生的還原當(dāng)量沿電子傳遞時，釋放出的能量可將H+從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜的胞液面，形成跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度。當(dāng)質(zhì)子從線粒體胞液面順梯度到基質(zhì)時，其中蘊(yùn)含的能量能將ADP與磷酸結(jié)合生成ATP。若H+進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，不能參與ATP合成，則能量以熱量的形式散失。心肌是高能量組織，其工作需要大量ATP，而UCP2表達(dá)下降，質(zhì)子漏得到抑制，使ΔuH+升高，有利于ATP的合成，防止細(xì)胞內(nèi)酸中毒，避免心肌細(xì)胞凋亡。另外，UCP2表達(dá)下降抑制質(zhì)子漏，電子沿呼吸鏈傳遞也受到抑制，結(jié)果使活性氧簇生成增加。由此可見，UCP2的表達(dá)本身就是一把“雙刃劍”，但給心肌提供能量要比活性氧簇生成增加重要。這是因為給心肌提供能量能夠維持整個細(xì)胞和組織器官的功能，該過程生成的活性氧簇在生理情況下可由SOD清除，在病理情況下UCP2的表達(dá)僅僅是個代償機(jī)制，只有UCP2表達(dá)下降才能恢復(fù)機(jī)體正常生理功能。因此，UCP2 mRNA的表達(dá)下降也是對心肌的一種保護(hù)。

圖1 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化（10×40）

圖2 WSC對心肌IRI大鼠心肌組織中UCP2 mRNA表達(dá)的影響

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Protective effect of water-soluble chitosan on rat myocardial ischemia reperfusion injury

REN Yan-feng＊，F(xiàn)EI Rui，MA Jia-nan，et al.＊Department of Cardiology，Central Hospital of Xinxiang，Xinxiang 453000，China

FEI Yu，E-mail：feiyusir@163.com

Objective To investigate the protective effects of WSC on myocardial IRI in rats and its mechanism，to provide experimental basis for drug prevention and treatment of myocardial IRI.Methods 60 SD rats were randomly divided into sham operation group，IRI model group，low dose WSC group，medium dose WSC group，high dose of WSC group，12 rats in each group.Among them，the IRI model group and each dose group WSC rats by left thoracotomy anterior interventricular branch of left coronary artery was ligated to establish IRI rat model，the rats in the sham operation group only isolated without ligation of the left anterior descending coronary artery.Sham operation group and IRI model group were given normal saline 10 ml/kg，low dose WSC group，middle dose of WSC group and high WSC group were given 120 mg/kg，180 mg/kg and 240 mg/kg，by gavage once a day，the rats were sacrificed after 15 d，heart blood，serum separation，ELSIA was used to detect the serum SOD and MDA levels.Near the apex of 1/3 parallel to the atrioventricular groove of transverse cut fresh myocardial tissue after fixation，paraffin embedding.The morphological changes of myocardial tissue were observed with HE staining.The expression of UCP2 mRNA in detecting myocardial tissue was observed with RT-PCR.Results Under the light microscope，in sham operation group，the myocardial fibers arranged orderly，clear structure，clear nuclear staining，and myocardial interstitial has no inflammatory cell infiltration.In IRI model group rats myocardial fibers showed disorder，boundary was not clear，and lightly stained cytoplasm，nucleus condensed or dissolved，a large number of inflammatory cells infiltration，hyperemia，congestion，myocardial fiber stripes disappear，myocardial tissue necrosis were observed；In intervention group WSC showed muscle fiber melt fracture phenomenon of myocardial cells，granular degeneration，edema，inflammatory cell infiltration and occasional.Compared with the sham operation group，IRI model group，SOD levels were significantly decreased，while the level of MDA and UCP2 mRNA expression in myocardial tissue were significantly increased（P<0.01），compared with the IRI model group，low dose WSC group，medium dose WSC group and high dose WSC group could significantly increase the level of SOD，reduce the expression of UCP2 mRNA and the level of MDA myocardial tissues（P<0.05，P<0.01）.Conclusion WSC can attenuate myocardial IRI，has a protective effect on myocardium of IRI rats.This effect may be related to the oxidative stress reaction against IRI.

Water-soluble chitosan；Superoxide dismutase；Malondialdehyde；Uncoupling protein 2

吉林省自然科學(xué)基金資助（項目編號：201215058）

453000 河南省新鄉(xiāng)市，新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心內(nèi)科（任彥鋒、劉志強(qiáng)、王霞）；

吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（費(fèi)瑞、馬佳男）；吉林大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科（費(fèi)瑜）

費(fèi)瑜，E-mail：feiyusir＠163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.11.019

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2015）11-1037-05

2015-07-16）