龐昇澤　孫潔　禤維言等

摘要 [目的]研究低溫脅迫下桂蕉6號幼苗葉片差異蛋白的表達。[方法]分別用TCA/丙酮法和酚抽提法提取桂蕉6號幼苗葉片總蛋白；用2DE電泳分析低溫脅迫處理和常溫下桂蕉6號葉片差異蛋白的表達。[結(jié)果]酚抽提法提取的總蛋白垂直電泳效果更好；從2DE圖譜中獲得了一些具明顯差異表達的蛋白點16個，其中表達上調(diào)的8個，表達下調(diào)的7個，低溫處理幼苗葉片特有蛋白1個；成功鑒定9個。[結(jié)論]酚抽提法更適合提取香蕉葉片總蛋白。

關(guān)鍵詞 桂蕉6號；低溫脅迫；雙向電泳；差異蛋白

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-032-03

Abstract [Objective] To research differences in protein expression of Guijiao No.6 seedling leaves. [Method] TCA/acetone method and phenol extraction method were both used to extract the total protein of Guijiao No.6 seedling leaves.2DE electrophoresis was used to analyze differences in protein expression of Guijiao No.6 seedling leaves under low temperature stress. [Result] The effect of vertical electrophoresis of protein extracted by phenol extraction method was the better one.Some significantly differentially expressed protein spots were discovered on 2DE maps. 16 obviously differential expressed protein spots were discovered， including 8 spots up， 7 spots down and 1 unique spot for the seedling leaves under low temperature stress in differential protein electrophoresis of 2DE. 9 spots were successfully identified. [Conclusion] Phenol extraction method was more suitable to extract the total protein of banana leaves.

Key words Guijiao No.6； Low temperature stress； Twodimensional electrophoresis； Differences in protein

香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）植物，原產(chǎn)于亞洲東南部，包括中國東南地區(qū)、馬來西亞、新幾內(nèi)亞和菲律賓。香蕉是世界上產(chǎn)量最大的三大水果之一，也是許多發(fā)展中國家除水稻、小麥、玉米之外的重要糧食作物[1]。香蕉是熱帶水果，對溫度條件的要求較高，喜高溫多濕，怕低溫，忌霜寒，最適宜溫度為24～32 ℃，15 ℃以下就會發(fā)生低溫冷害[2]。低溫會抑制香蕉發(fā)育，降低其生長速率，更為嚴重的低溫會使香蕉遭受不可逆的危害，從而極大地影響香蕉生產(chǎn)，導(dǎo)致減產(chǎn)低產(chǎn)。2008年1月中旬至2月中旬，廣西受到建國以來最強的一次平流型低溫陰雨災(zāi)害天氣影響，給香蕉等熱帶水果造成嚴重寒害[3]。

植物在環(huán)境脅迫下的機理一直是研究熱點之一，近年來，關(guān)于水稻、小麥、甘藍等植物的低溫脅迫研究取得了相當大的進展，包括生理生化特征、低溫脅迫蛋白以及響應(yīng)低溫脅迫的蛋白及基因表達調(diào)控等方面的研究[4-6]。而關(guān)于香蕉在低溫脅迫下的生理學(xué)、栽培學(xué)和氣象學(xué)方面的研究使香蕉的防寒技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，但其低溫脅迫下分子生物學(xué)機制目前仍不清楚[7-9]。運用蛋白雙向電泳技術(shù)獲得差異表達蛋白，通過生物信息學(xué)，對低溫脅迫過程中的某些特異表達蛋白進行系統(tǒng)研究成為近年來解析香蕉低溫脅迫下的分子生物學(xué)機制的重要突破口[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗品種為廣西大面積種植的桂蕉6號（購自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所），選取株高30 cm左右、七葉一心、長勢均勻、無病蟲害的幼苗為試驗材料。

1.2 材料處理

將選取的香蕉幼苗置于溫室培養(yǎng)15 d后，移16盆到光照培養(yǎng)箱（白天光照強度為7 500 lx，晚上為0 lx，光照時間12 h/d）中，將溫度控制在7 ℃，其他培養(yǎng)條件不變。于12、24、48、96 h后分別取樣，取樣時剪取倒三葉迅速與液氮保存，取樣完畢后放入-80 ℃保存?zhèn)溆?。其中? h作為對照。

1.3 香蕉葉片總蛋白質(zhì)的提取

1.3.1

TCA/丙酮法。采用改良的TCA/丙酮法[11]。

1.3.2

酚抽提法。參照Carpentier等[12]的方法。

1.4 蛋白質(zhì)的裂解與定量

裂解液成分為7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS和1%DTT。

采用Bradford法對提取的蛋白進行定量。

1.5 垂直SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白

分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%，每個泳道蛋白上樣量為30 μg；開始電流恒定在10 mA，當進入分離膠后改為20 mA；電泳后膠塊染色[（0.2%（W/V）考馬斯亮藍G250，40%（V/V）甲醇，10% （V/V）冰乙酸）]1 h；染色后的膠塊用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液[（5%（V/V）甲醇，7.5%（V/V）冰乙酸）]脫色至背景清晰。

1.6 雙向凝膠電泳分離蛋白

第一向等電聚焦（IEF）的膠條24 cm，pH為4～7，上樣量為450 ug。第二向SDSPAGE凝膠濃度為12.5%，在垂直電泳槽中進行電泳，用銀染法染色。

1.7 圖像分析

用Umax描儀掃描，Image Master 2D Platinum軟件分析2DE凝膠圖像。

1.8 質(zhì)譜鑒定

采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，包括酶解、點靶、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫搜索等。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種不同蛋白提取方法的SDSPAGE結(jié)果對比

2種不同蛋白質(zhì)提取方法所提取的香蕉幼苗葉片蛋白的垂直SDSPAGE電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，2種方法提取的蛋白經(jīng)SDSPAGE分離后條帶數(shù)目無明顯差異，但染色深淺差異明顯，酚抽提法所得到的蛋白染色更深，也更清晰。

2.2 2DPAGE分離蛋白結(jié)果

選擇可比性較好的電泳圖譜，調(diào)整未經(jīng)過低溫處理和經(jīng)過低溫處理的桂蕉6號幼苗葉片蛋白2DE圖譜的背景，修改和檢測圖譜上的點。用ImageMaster 2D platinum軟件分析時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過低溫處理的幼苗葉片蛋白2DE圖譜與未經(jīng)過低溫處理的幼苗葉片蛋白2DE圖譜相比，出現(xiàn)一些差異蛋白點。差異點蛋白圖譜見圖2。

由圖2可知，以未經(jīng)低溫處理的為參考膠，分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)過低溫處理的幼苗葉片和未經(jīng)過低溫處理的幼苗葉片存在顯著表達差異的蛋白點16個，其中表達上調(diào)的8個（6、7、8、9、13、14、15、16），表達下調(diào)的7個（1、2、3、4、10、11、12），經(jīng)過低溫處理的幼苗葉片特有的1個（5）。這16個蛋白點在圖譜中表現(xiàn)穩(wěn)定，易于從凝膠上挖取下來用作下一步質(zhì)譜鑒定。

2.3 質(zhì)譜結(jié)果

對有明顯表達差異的16個蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定，所有的測定樣品都得到了完整的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。其中9個蛋白點（1、2、3、4、5、6、7、8、9）通過膠內(nèi)酶解，質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果見表1。

2.4 差異蛋白序列相似性比對

在NCBI中通過蛋白gi號獲得氨基酸序列，然后根據(jù)氨基酸序列在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中通過序列對比，搜索出與之序列相似性最高的蛋白，并獲得蛋白的相關(guān)序列ID，結(jié)果見表2。

3 討論

樣品制備是雙向電泳技術(shù)成功的關(guān)鍵，蛋白質(zhì)的提取方法有很多種[13]，但沒有一種方法普遍適用于所有物種，因為每種提取方法都有各自的特點。如TCA/丙酮法作為一種傳統(tǒng)的蛋白提取方法，具有操作簡便、減少蛋白降解等特點，但提取后的蛋白不易復(fù)溶導(dǎo)致蛋白提取率低，是SDSPAGE條帶淺的重要原因；而酚抽提法也會由于操作步驟中較易損失蛋白，導(dǎo)致后續(xù)雙向電泳得到的蛋白點相對較少。因此，最適合提取蛋白的方法，因物種、組織以及目標蛋白的不同而各異。韋玉梅等[14]研究表明，酚/SDS法適合煙草葉片蛋白的提??；王卓等[15]研究表明，酚抽提法適合香蕉果實蛋白的提??；梁書劍等[16]研究表明Mg/NP40法更適合分離分子量為14～20 kD或大于67 kD等電點在5～7的蛋白質(zhì)，TCA法更適合分離分子量在31～67 kD等電點在4～5的蛋白質(zhì)。該試驗通過對2種提取方法提取桂蕉6號幼苗葉片蛋白垂直電泳效果的對比可見，用酚抽提法提取香蕉幼苗葉片組織蛋白整體效果更好，說明提取香蕉葉片總蛋白用酚抽提法更合適，這與祁君鳳等[10]的研究結(jié)果一致。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能夠在短時間內(nèi)從蛋白混合物中鑒定出其組分，目前分析串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用最多的是基于數(shù)據(jù)庫搜索的鑒定算法，如Mascot等[17]。質(zhì)譜鑒定不成功的原因可能與香蕉蛋白數(shù)據(jù)庫不完善有關(guān)，盡管在試驗中得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)，但往往得不到理想的鑒定結(jié)果；也可能與凝膠上蛋白點的大小、位置等不適合作質(zhì)譜鑒定有關(guān)[11]。

香蕉果實與香蕉品質(zhì)直接相關(guān)，其低溫脅迫下的響應(yīng)機制已涉及差異蛋白與核酸信息的綜合研究[18]。該試驗以屬香芽蕉的桂蕉6號幼苗葉片為研究對象，獲得的差異蛋白點少于祁鳳君[10]以巴西蕉幼苗葉片為材料獲得的28個，鑒定結(jié)果有屬相同家族的蛋白（差異點1、4、6），無相同蛋白。這可能與試驗材料的低溫敏感性不同有關(guān)；也可能與建立的雙向電泳體系不同有關(guān)。該研究獲得的差異蛋白點少于周萍[11]以水稻冷敏感品系9 311為材料研究獲得的28個，鑒定結(jié)果無屬相同家族的蛋白，也無相同蛋白，且該研究成功鑒定的蛋白分子量最大值和等電點最大值都明顯更大，數(shù)值范圍也更廣，說明低溫脅迫下香蕉幼苗葉片差異表達蛋白點在圖譜上更分散。

該試

驗鑒定出的表達上調(diào)或下調(diào)的蛋白點可以運用蛋白印跡檢測進行確認，得到的差異表達蛋白序列相似性比對結(jié)果，可以通過Quickgo獲取相關(guān)蛋白的氨基酸序列、大概參加的通路、分子功能等信息，綜合起來推測差異蛋白的相關(guān)功能，為揭示香蕉抵御低溫的機制和品種的培育提供更多的依據(jù)和支持。

4 結(jié)論

（1）用酚抽提法來提取香蕉葉片總蛋白比TCA/丙酮沉淀法更合適。

（2）采用24 cm，pH 4～7，450 μg上樣量雙向電泳體系，從圖譜中分析得到有明顯差異表達蛋白點16個，其中表達上調(diào)的8個，表達下調(diào)的7個，經(jīng)過低溫處理的幼苗葉片特有的1個。

（3）成功鑒定9個差異表達蛋白點。

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