劉　安　陳余清　孫　哲　王效靜　李　偉　閔生萍

非小細胞肺癌EGFR基因突變與臨床特征分析

劉安陳余清孫哲王效靜李偉閔生萍

目的 探討非小細胞肺癌（NSCLC）中表皮生長因子受體（EGFR）基因突變特點與臨床特征的關(guān)系。方法 130例NSCLC腫瘤組織，分別提取DNA，采用突變特異性擴增系統(tǒng)（ARMS）擴增檢測EGFR基因外顯子18、19、20、21的突變情況。結(jié)果 130例NSCLC共檢出57例EGFR基因突變（43.8%），其中18、19、20、21單獨突變分別為1例（0.8%）、26例（20%）、1例（0.8%）、23例（17.7%），主要突變類型為19外顯子缺失（構(gòu)成比45.6%）和外顯子21 L858R（構(gòu)成比38.6%）。女性患者突變率高于男性患者（65.9% vs 31.3%，P＜0.01）。腺癌患者突變率高于鱗癌患者（51.6% vs 22.9%，P＜0.01）。不吸煙患者突變率高于吸煙患者（55.3% vs 27.8%，P＜0.01）。未發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變率與年齡、病變部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論 NSCLC患者EGFR基因突變以19、21外顯子突變?yōu)橹?，突變以女性、腺癌、不吸煙患者較多見。

非小細胞肺癌 表皮生長因子受體 基因突變

近年來，肺癌已成為我國病死率最高的惡性腫瘤之一，其中以非小細胞肺癌（NSCLC）的發(fā)病率最高，約占85%～90%。其中大部分患者確診時已屬于中晚期，采用常規(guī)化療藥物治療，并不能使患者最大程度獲益。隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，腫瘤治療逐步進入分子靶向治療時代，表皮生長因子受體（EGFR）的小分子酪氨酸酶抑制劑（TKTs）類靶向藥物，已廣泛應(yīng)用于NSCLC的治療，并顯示出良好的效果，提高了患者的生存質(zhì)量［1］。本資料檢測了130例NSCLC患者的EGFR突變情況，同時探討EGFR突變與其臨床特征的關(guān)系，旨在為臨床中篩選最適合的患者進行針對性分子靶向治療提供依據(jù)，避免不合理用藥。報道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集2012年6月至2014年6月本院呼吸與危重癥醫(yī)學科診治的NSCLC患者130例，其中男83例，女47例；年齡33～88歲，中位年齡 63歲。有吸煙史54例、無吸煙史76例。收集超聲支氣管鏡（EBUS）、支氣管鏡、內(nèi)科胸腔鏡活檢和經(jīng)CT、B超引導下穿刺活檢原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶組織標本。所有腫瘤組織標本切片后，均經(jīng)HE染色，由兩名病理科醫(yī)生確診為NSCLC。其中腺癌95例、鱗癌35例。所有NSCLC患者術(shù)前未接受過放化療和EGFR-TKI等抗腫瘤治療。

1.2標本采集 活檢標本，采用中性福爾馬林溶液固定石蠟包埋，經(jīng)病理科醫(yī)生評估并選取腫瘤細胞＞50%的石蠟組織，切取8μm厚的石蠟切片5～10片，置于無菌的EP試管內(nèi)。

1.3DNA提取 采用德國凱杰公司的QIAamp DNA FFPE Tissue kit試劑盒，并按試劑盒說明書提取DNA，采用美國賽默飛公司的Thermo Scientific NanoDrop2000超微量分光光度計測定DNA純度及濃度，要求A280/ A260在1.8～2.0。

1.4實時熒光定量PCR擴增 采用擴增耐受突變系統(tǒng)（ARMS）擴增EGFR基因18、19、20及21外顯子。具體操作方法按人類EGFR基因突變檢測試劑盒（蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司）說明進行。每次實驗均設(shè)定各突變陰、陽性對照孔及空白對照孔，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃ 5min；95℃ 20s，57℃ 32s，循環(huán)5次；95℃ 20s，60℃ 35s，循環(huán)40次。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1EGFR基因突變情況 在130例NSCLC患者中共檢出EGFR基因突變57例，突變率為43.8%。其中18、19、20、21外顯子單獨突變率分別為0.8%、20%、0.8%、17.7%，構(gòu)成比分別為1.8%、45.6%、1.8%、40.4%。外顯子18為G719S突變1例，外顯子19為架內(nèi)多核苷酸缺失26例，外顯子20為S768I突變1例，外顯子21為L858R突變22例及1例L861Q。另外包含6例多點突變，分別為外顯子18和外顯子19雙突變1例，外顯子19和外顯子21 L858R雙突變4例，外顯子18和外顯子21 L858R雙突變1例。

2.2EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系 見表1。

表1　EGFR基因突變與臨床特征關(guān)系

3　討論

EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，在較多腫瘤中過度表達和（或）發(fā)生突變，通過信號傳導來控制腫瘤生長速度，并與新生血管生長、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等有密切聯(lián)系［2］。研究表明，肺癌患者對EGFRTKIs的敏感性與EGFR基因外顯子18～21突變有關(guān)，EGFR-TKI在突變患者中的有效率＞70%，而在非突變患者有效率僅為10%左右［3～5］。因此，檢測腫瘤組織EGFR基因突變情況對于指導NSCLC患者臨床EGFRTKI治療具有極其重要的意義。EGFR基因位于7號染色體短臂7P12～14區(qū)，由28個外顯子構(gòu)成，其酪氨酸激酶功能區(qū)由18～24號外顯子編碼。對EGFR基因突變的數(shù)據(jù)分析表明，盡管突變部位分散在整個酪氨酸激酶編碼區(qū)，但90%的突變集中在第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R的點突變［6］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑EGFR-TKI對非小細胞的療效與EGFR基因外顯子突變有關(guān)［7］，且突變多發(fā)生于女性、非吸煙、腺癌患者［8］。據(jù)文獻報道NSCLC患者EGFR基因酪氨酸激酶功能區(qū)的突變具有顯著的地域與種族差異性。歐美地區(qū)NSCLC患者中僅10%有EGFR的基因突變，但是在亞洲地區(qū)NSCLC患者中EGFR基因突變率為30%，而在亞洲地區(qū)肺腺癌患者中突變率高達25%～50%［9］。本資料發(fā)現(xiàn)，130例NSCLC患者中EGFR的總突變率為43.8%（57/130），且肺腺癌患者突變率為51.6%（49/95），與亞洲地區(qū)肺腺癌突變率基本相符。說明130例NSCLC中肺腺癌EGFR突變率高于其他病理類型，明顯高于歐美地區(qū)。

Rosell等［10］報道了2105例NSCLC患者EGFR突變與臨床特征的關(guān)系，EGFR基因在女性患者中的突變率為69.7%，高于男性30.3%。非吸煙患者突變率為66.6%，高于吸煙患者33.4%。但在不同年齡組NSCLC患者中無明顯差異。本資料中，男性患者的EGFR基因突變率為31.3%（26/83），明顯低于女性患者突變率65.9%（31/47），兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。鱗癌患者EGFR基因突變率為22.9%（8/35），明顯低于腺癌患者突變率為51.6%（49/95），兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。吸煙患者的EGFR基因突變率為27.8%（15/54），非吸煙患者的突變率為55.3%（42/76），兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。≤60歲的患者EGFR基因突變率為52.3%（23/44），＞60歲患者的突變率為39.5%（34/86）兩者之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。左側(cè)腫瘤EGFR基因突變率為40.7%（24/59），右側(cè)腫瘤突變率為46.5%（33/71），兩者之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的EGFR基因突變率為36.4%（8/22），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移突變率為45.4%（49/108），兩者之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。進一步證實了EGFR基因在女性、非吸煙、腺癌患者中有較高的突變率，而與患者的年齡、病變位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

國外學者Mitsudomo等［11］對568例NSCLC患者EGFR基因突變分析為90%基因突變主要集中在19外顯子缺失與21外顯子點突變。NSCLC患者EGFR基因突變中，19外顯子缺失突變占45%～62%，21外顯子L858R突變稍低，占35%～45%.但未見不同地區(qū)之間兩種主要突變類型存在明顯差異報道。而國內(nèi)學者報道，中國不同地區(qū)NSCLC患者基因突變類型存在明顯差異。北京、上海地區(qū)EGFR基因第19和21外顯子突變占總突變率的比例相近約為45%。廣東、云南地區(qū)EGFR突變以第19外顯子為主，廣東地區(qū)19外顯子突變占59.1%，21外顯子突變占27.3%；云南地區(qū)19外顯子突變占36.2%，外顯子21突變罕見，僅為1.72%［12，13］。臺灣地區(qū)NSCLC患者EGFR突變以外顯子21為主，其突變率為19.8%，占總突變率的76%［14］。本資料中，檢測130例NSCLC患者19外顯子缺失構(gòu)成比45.6%（26/57）和外顯子21 L858R構(gòu)成比 38.6 %（22/57）。與北京、上海地區(qū)EGFR突變主要類型大致相符。而與其他地區(qū)不同。進一步說明了我國不同地區(qū)之間EGFR基因突變類型存在差異。其差異性可能與民族、地域、遺傳背景等有相關(guān)性，有待進一步研究。

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Objective To investigate gene mutations of the epidermal growth factor receptor（EGFR）in patients with non -small cell lung cancer（NSCLC）in Anhui and analyze the correlation between mutations and clinical features.Methods Specimens of lung cancer tissues were collected from 130 NSCLC patients in our hospital.DNA was extracted.Mutations of EGFR exons 18，19，20 and 21 were detected by amplifi cation refractory mutation system（ARMS）.Results Mutations were foud in 57 cases of 130 lung cancer samples， with an incidence of 43.8%.，among which，mutations located at exon 18，19，20 and 21 were reported in 1 case（0.8%），26 cases（20%），1 case（0.8%），23 cases（17.7）. The mutation of deletion at exon 19（45.6% 26/57）and exon 21 L858R（38.6% 22/57）were the predominant mutations. Mutation in female patients was higher than in male（65.9% vs 31.3% P＜0.01）. Mutation in adenocareinoma patients was higher than squamous carcinoma patients（51.6% vs 22.9% P＜0.01）. Mutation in Non - smokers was higher than smokers（55.3% vs 27.8% P＜0.01）.The mutation rate of EGFR had no correlation with the age，lesion location and lymph node metastasis of patients with NSCLC（all P＞0.05）.Conclusion Exon 19and 21 mutation were predominant in EGFR gene mutation in NSCLC in Anhui.These mutations were more frequently detected in female，adenocarecinoma and non-smoking patients.

Non-small cell lung cancer Epidermal growth factor receptor Gene mutation

233000 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科