毛文文 尹列芬 田偉盟 陳國(guó)強(qiáng) 周 寧 申政磊 (昆明市第二人民醫(yī)院老年科，云南 昆明 65004)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)亦稱(chēng)內(nèi)皮前體細(xì)胞，是指能分化增殖為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的一群祖細(xì)胞〔1〕。目前，EPCs介導(dǎo)的血管再生及損傷血管修復(fù)已經(jīng)成為糖尿病(DM)、心血管疾病、腫瘤等疾病中的研究熱點(diǎn)，2型糖尿病(T2DM)中血管損傷機(jī)制的揭示受到許多學(xué)者的關(guān)注〔2，3〕。本研究觀察T2DM患者外周血EPCs數(shù)量及其功能，探討二者在T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1病例選擇 我院2009年9月至2012年10月老年科住院患者，共30例，男15例，女15例，年齡60～76歲，中位年齡65.2歲。經(jīng)檢查確定無(wú)冠心病、高血壓、感染病史。正常老年對(duì)照組 10例，男7例，女3例，年齡60～75歲，中位年齡64.1歲，無(wú)糖尿病、冠心病、高血壓、近期感染等病史。

1.2材料與試劑 人淋巴細(xì)胞分離液、胎牛血清、M199培養(yǎng)液、二甲基亞砜(DMSO)、人纖維連接蛋白、流式細(xì)胞儀、DiI乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)、FITC標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)(云南省腫瘤研究所);CD45-Cy5，CD133-RPE等標(biāo)記(上海生物科技有限公司)。

1.3EPCs分離、鑒定、黏附數(shù)目檢測(cè)

1.3.1EPCs分離 取外周血10 ml，肝素抗凝，密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞。將單個(gè)核細(xì)胞接種在24孔板。M199培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)培養(yǎng)4 d，用磷酸鹽緩沖(PBS)液洗掉非貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d，PBS液洗掉非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3.2EPCs細(xì)胞鑒定 分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，按(2～3)×106/ml接種在纖連蛋白包被24孔板及6孔板(內(nèi)置細(xì)胞爬片)，細(xì)胞爬片于培養(yǎng)第4天取出，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定FITC標(biāo)記荊豆凝血素Ⅰ(FITC-UEA-I)和DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-acLDL)雙陽(yáng)性細(xì)胞為正常分化的EPCs。

1.3.3EPCs黏附數(shù)目(TNE-A)檢測(cè) 用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500 μl培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，然后將同等數(shù)目的EPCs鋪在24孔板，在37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)1 h后，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。計(jì)數(shù)15個(gè)隨機(jī)200倍視野中貼壁細(xì)胞。

1.4EPCs的數(shù)量檢測(cè)(TNE)

1.4.1細(xì)胞表面標(biāo)志 采用CD45-Cy5，CD133-RPE等標(biāo)記。EPCs:CD133+/CD45-。

1.4.2檢測(cè)方法 采用熒光抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。抽取外周血3 ml，抗凝，血標(biāo)本用PBS液2倍稀釋?zhuān)現(xiàn)icoll分離，1 800 r/min離心20 min，PBS洗2次。將細(xì)胞加入96孔板中，每孔5 ×105個(gè)細(xì)胞，加入抗體 5 μl，4 ℃ 孵育 30 ～60 min，用PBS液洗滌標(biāo)本2次，100 μl的1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.3統(tǒng)計(jì)軟包，數(shù)據(jù)以s表示，組間比較采用方差分析，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析及Logistic多因素回歸分析。

2結(jié)果

2.1T2DM各組檢測(cè)指標(biāo)與正常對(duì)照組情況 T2DM患者TNE-A(細(xì)胞數(shù)/200倍視野)較正常對(duì)照組顯著減少，并且血管病變各組間也有差異(t=2.185、2.099;P＜0.05)。T2DM患者外周血TNE較正常對(duì)照組減低(t=2.179;P＜0.05)，但血管病變各組間無(wú)差異(t=1.857;P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組檢測(cè)指標(biāo)水平比較(s)

表1 各組檢測(cè)指標(biāo)水平比較(s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與T2DM組及無(wú)血管病變組比較:2)P＜0.05

指標(biāo) T2DM組(n=30)無(wú)血管病變組(n=10)微血管病變組(n=10)大血管病變組(n=10)正常對(duì)照組(n=10)男/女(n)體重指數(shù)(kg/m2)空腹血糖(FBG，mmol/L)餐后血糖2 h(2 h PBG，mmol/L)糖化血紅蛋白(HbA1c，%)總膽固醇(TC，mmol/L)低密度脂蛋白(LDL，mmol/L)高密度脂蛋白(HDL，mmol/L)甘油三酯(TG，mmol/L)尿白蛋白/Cr(mg/g)收縮壓(SBP，mmHg)舒張壓(DBP，mmHg)血小板(×109/L)纖維蛋白原(g/L)TNE-A(個(gè))EPCs計(jì)數(shù)(%)6/4 21.8±3.0 5.7±0.2 7.4±0.43－4.0±1.0 2.2±0.4 1.2±0.4 1.3±0.5－113.2±9.5 73.6±9.3 169 3.8 50.20±5.02 0.087±0.013 17/13 25.1±4.2 9.6±2.8 14.2±2.7 9.9±0.8 5.4±0.6 3.2±0.1 1.3±0.1 1.8±1.1 46.2±2.8 131.3±15.4 77.9±6.3 267 5.3 39.20±4.521)0.045±0.0031)6/4 24.6±1.5 11.1±3.5 13.9±4.2 9.6±2.7 5.1±1.3 2.8±0.9 1.1±0.1 1.5±0.7 43.9±2.5 141.9±13.4 78.6±6.5 256 4.2 41.15±3.271)0.040±0.0131)5/5 25.2±3.1 10.4±2.1 14.5±3.9 9.3±2.5 5.8±0.4 3.4±0.7 1.3±0.4 1.6±0.4 53.4±2.7 121.2±14.6 81.2±9.4 173 5.6 33.15±3.271)2)0.057±0.0131)4/6 24.9±3.2 11.6±3.6 14.6±4.1 10.7±4.1 5.7±0.9 4.9±0.5 0.9±0.3 2.0±1.7 69.9±5.1 132.4±25.3 80.9±12.2 362 4.7 28.23±2.871)2)0.049±0.0041)

2.2T2DM患者(按FBG分組)與正常對(duì)照組TNE-A對(duì)比 見(jiàn)表2。T2DM患者TNE-A較正常對(duì)照組顯著減少(t=2.872，P＜0.01);T2DM隨血糖升高，TNE-A逐漸降低，組間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.122，P＜0.05)。T2DM患者外周血TNE-A較正常對(duì)照組減低(t=2.855，P＜0.01);T2DM患者隨血糖升高，TNE-A也逐漸降低，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.103，P＜0.05)。

表2 不同F(xiàn)BG水平的T2DM患者EPCs檢測(cè)結(jié)果(s)

表2 不同F(xiàn)BG水平的T2DM患者EPCs檢測(cè)結(jié)果(s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與其他組比較:2)P＜0.05，下表同

FBG(mmol/L)TNE-E(個(gè))EPCs計(jì)數(shù)(%)＜7.8(n=7)39.20±4.521) 0.060±0.0101)7.8～11.1(n=11)33.15±3.271) 0.055±0.0111)＞11.1(n=12)28.23 ±2.871)2) 0.034±0.0211)2)正常對(duì)照組(n=10)50.20±5.02 0.087±0.013

2.3T2DM患者(按HbA1c分組)與正常對(duì)照組結(jié)果對(duì)比T2DM患者 TNE-A較正常對(duì)照組顯著減少(t=2.985，P＜0.01);T2DM患者隨HbA1c升高，TNE-A逐漸降低，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.105，P＜0.05)。T2DM患者外周血TNE數(shù)較正常對(duì)照組減低(t=2.861，P＜0.01);T2DM患者隨HbA1c升高，TNE數(shù)逐漸降低，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.175，P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同HbA1c水平T2DM患者EPCs檢測(cè)結(jié)果(s)

表3 不同HbA1c水平T2DM患者EPCs檢測(cè)結(jié)果(s)

HbA1c水平 TNE-A(個(gè))EPCs計(jì)數(shù)(%)＜8%(n=9)40.35±4.291) 0.071±0.0351)8% ～12%(n=10)32.21±4.011) 0.049±0.0251)＞12%(n=11)25.22±2.451)2) 0.030±0.0191)2)正常對(duì)照組(n=10)52.12±4.14 0.087±0.013

2.4T2DM患者相關(guān)性以及預(yù)后因素分析 Spearman相關(guān)分析顯示，TNE-A水平與LDL、DBP呈負(fù)相關(guān)(r分別為－0.40、－0.39，P ＜0.01)，與 2hPBG、HbA1c也呈負(fù)相關(guān)性(r分別為－0.21、－0.24，P＜0.05)。而外周血TNE數(shù)與FBG、HbA1c蛋白呈負(fù)相關(guān)(r分別為－0.231、－0.267，P＜0.05)。兩者與上述其他因素?zé)o關(guān)聯(lián)。以T2DM為整體，有血管病變?yōu)橐蜃兞?有 =1，無(wú) =0)，以年齡、性別、SBP、DBP、BMI、HbA1c、TG、TC、LDL-C、HDL-C、FPG、2hPG、血小板計(jì)數(shù)、纖維蛋白原、TNEA、TNE數(shù)目等因素為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。最后SBP、TNE-A 進(jìn)入回歸方程，常數(shù)為 －14.617、21.632。

3討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者，特別在并發(fā)大血管病和微血管病時(shí)，體內(nèi)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)、EPCs均發(fā)生數(shù)量和功能的變化。糖尿病的嚴(yán)重程度與血管內(nèi)皮損傷和功能障礙的程度密切相關(guān)〔1〕。大量研究顯示黏附分子、細(xì)胞因子、糖基化終末產(chǎn)物、脂類(lèi)代謝紊亂等在分子水平上參與T2DM新生血管的形成，其中與上述因素有著密切關(guān)系的內(nèi)皮細(xì)胞、EPCs的研究正成為熱點(diǎn)〔2，3〕。本研究參考國(guó)內(nèi)外研究成果，從 EPCs入手，從其功能與數(shù)量?jī)煞矫嫣接懫湓赥2DM患者體內(nèi)的變化，并與相關(guān)臨床因素對(duì)比分析。

T2DM患者體內(nèi)EPCs黏附細(xì)胞數(shù)可以反映其黏附功能，其參與血管生成、血管損傷修復(fù)等，在糖尿病血管病變發(fā)生中占有重要地位。而外周血EPCs的數(shù)量反映了內(nèi)皮在各種因素刺激下的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者體內(nèi)EPCs黏附細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組顯著減少，并且隨血糖、血脂、血壓有一定的關(guān)聯(lián)。目前相關(guān)文獻(xiàn)〔4〕顯示糖尿病患者體內(nèi)一些指標(biāo)如可溶性細(xì)胞間黏附分子1、血漿假性血友病因子等參與糖尿病血管病變，但分析發(fā)現(xiàn)它們與血脂、血壓相關(guān)聯(lián)，而與血糖及HbA1c水平無(wú)明顯相關(guān)性，從而認(rèn)為它們不是血糖升高的直接后果，而可能與DM患者體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶糖化反應(yīng)及氧化應(yīng)激增強(qiáng)等因素有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果提示EPCs的功能變化可能是體內(nèi)代謝變化的聯(lián)系環(huán)節(jié)。同時(shí)，本研究外周血EPCs細(xì)胞數(shù)目與血脂、血壓等反映血管病變的因素相關(guān)性較低或無(wú)相關(guān)性的結(jié)果可能從另一個(gè)側(cè)面也支持上述結(jié)論。本研究提示EPCs細(xì)胞數(shù)目受到影響因素較多，早期代償機(jī)制是其數(shù)目增加的主要因素，隨著病變加重，代償機(jī)制失控，一方面數(shù)量會(huì)降低，另一方面即便數(shù)量增多，功能上存在缺陷，無(wú)法起到其應(yīng)具有的功能，導(dǎo)致惡性循環(huán)，病情進(jìn)展。因此針對(duì) T2DM 的 EPCs移植治療〔5，6〕上，在保證EPCs數(shù)量的同時(shí)，其內(nèi)在功能更應(yīng)該受到重視。鑒于EPCs的研究剛剛起步，其生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步研究。

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