腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可減輕H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷

王詩(shī)才，陳太軍，黃美松，朱少銘

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可減輕H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷

王詩(shī)才，陳太軍，黃美松，朱少銘△

目的探討腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的影響及其作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞并以缺氧（95%N2+5%CO2）培養(yǎng)4 h后復(fù)氧（95%O2+5%CO2）培養(yǎng)12 h建立H/ R模型，并分為Control組、H/R組、不同濃度（1、10、100 μg/L）BDNF預(yù)處理后H/R組、酪氨酸蛋白激酶受體B（TrkB）inhibitor組（同時(shí)加入100 μg/L BDNF和1∶1 000的TrkB inhibitor預(yù)處理后H/R組）。利用MTT方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率；并測(cè)定各組心肌細(xì)胞H/R損傷后乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量及活性；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組心肌細(xì)胞的凋亡率；Western-blot檢測(cè)TrkB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果與Control組相比，H/R組細(xì)胞存活率明顯下降，LDH、CK和MDA含量升高，SOD活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)下降，促凋亡Bax蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05）。與H/R組相比，不同濃度BDNF預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞后H/R，各組細(xì)胞存活率均明顯上升，CK、LDH、MDA含量逐漸下降，SOD活性升高，細(xì)胞凋亡率下降，TrkB和Bcl-2蛋白表達(dá)升高，而Bax蛋白表達(dá)降低，但BDNF的作用均受到TrkB inhibitor的抑制。結(jié)論BDNF預(yù)處理能夠提高H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的細(xì)胞存活率，通過降低細(xì)胞凋亡率和提升細(xì)胞抗氧化能力而發(fā)揮保護(hù)作用，并與BDNF-TrkB信號(hào)通路有關(guān)。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；肌細(xì)胞，心臟；細(xì)胞低氧；受體，trkB；氧化性應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；缺氧/復(fù)氧損傷

臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)資料表明，心肌組織缺血再灌注（I/R）損傷嚴(yán)重影響缺血性心血管疾病的治療，是術(shù)后引發(fā)死亡的主要原因之一［1］。隨著再灌注治療在臨床的廣泛開展，I/R損傷問題已成為當(dāng)前臨床研究的焦點(diǎn)。近來研究表明心肌I/R過程中的氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞功能障礙及細(xì)胞凋亡參與了I/R損傷的發(fā)生［2］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neu?rotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的主要成員之一，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，具有維持神經(jīng)元存活和生長(zhǎng)的作用［3］。最新研究表明BDNF還廣泛表達(dá)于許多非神經(jīng)組織如血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌組織細(xì)胞中，并能夠調(diào)節(jié)血管損傷修復(fù)和促進(jìn)傷口愈合，說明神經(jīng)源性因素在心血管系統(tǒng)損傷修復(fù)中也能發(fā)揮作用［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)心肌組織缺血預(yù)處理時(shí)心肌細(xì)胞中BDNF mRNA和蛋白表達(dá)會(huì)明顯上調(diào)，提示BDNF可能會(huì)作為神經(jīng)源性的心肌保護(hù)因素之一在心肌I/R中發(fā)揮作用［5］，但其具體機(jī)制尚少見研究。本研究構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型模擬心肌I/R損傷，觀察BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的影響，并從抗細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激方面探討其作用機(jī)制及是否通過BDNF-TrkB信號(hào)通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑H9c2心肌細(xì)胞株購(gòu)自北京中科院細(xì)胞資源中心；DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；BDNF、酪氨酸蛋白激酶受體B（TrkB）抑制劑（TrkB-inhibitor）購(gòu)自美國(guó)R&D公司；二苯基溴化四氮唑（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司；FITC-Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物公司；多克隆兔抗鼠TrkB、Bcl-2、Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自北京博奧森生物公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 H/R模型的建立及心肌細(xì)胞分組將凍存復(fù)蘇的H9c2心肌細(xì)胞在10%胎牛血清及含雙抗（青霉素、鏈霉素）的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%以上時(shí)，消化收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建H/R損傷模型。先用以95%N2+5%CO2充分飽和的不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，并放入含95%N2+5%CO2的混合氣體的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h，后更換含胎牛血清的正常培養(yǎng)基放回含95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)12 h，以構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷模型。將培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞分為以下幾組：（1）正常對(duì)照未H/R損傷組（Control組）。（2）H/R組，即缺氧4 h后復(fù)氧培養(yǎng)12 h。（3）1 μg/L BDNF+H/R組，即1 μg/L BDNF預(yù)處理正常培養(yǎng)24 h后H/ R。（4）10 μg/L BDNF+H/R組，即10 μg/L BDNF預(yù)處理正常培養(yǎng)24 h后H/R。（5）100 μg/L BDNF+H/R組，即100 μg/L BDNF預(yù)處理正常培養(yǎng)24 h后H/R組。（6）TrkB inhibitor組，即100 μg/L BDNF和1∶1 000的TrkB inhibitor預(yù)處理正常培養(yǎng)24 h后H/R組。

1.2.2 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞，消化離心后收集并用培養(yǎng)基稀釋至5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照孔，即不加細(xì)胞按照同步驟處理，等細(xì)胞同步化培養(yǎng)貼壁后，按照上述分組分別處理各組細(xì)胞。等培養(yǎng)結(jié)束后，在每組各細(xì)胞孔中加入20 μL

的MTT溶液（5 mg/L），在37℃下繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h，棄去上清后在每孔中加入150 μL的DMSO溶液，振蕩反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在590 nm處的光密度（OD）值。每組同時(shí)設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。各組心肌細(xì)胞的存活率（%）=（處理組OD-空白對(duì)照組OD）/（Control組OD-空白對(duì)照組OD）× 100%。

1.2.3 LDH、CK、MDA及SOD含量測(cè)定將H9c2心肌細(xì)胞接種于24孔板中經(jīng)相同分組處理后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞的上清液，按照檢測(cè)試劑盒說明，利用比色法測(cè)定各組H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)不同處理H/R后CK、LDH的漏出量變化。同時(shí)收集各組處理完畢的細(xì)胞，利用RIPA蛋白提取試劑提取各組細(xì)胞中總蛋白，并按照試劑盒說明測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量及SOD活性變化。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)相同分組處理后，用含0.25%的EDTA胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌1遍后，用PBS重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，每組取出200 μL的細(xì)胞懸液，先用FITC標(biāo)記的Annexin-V和PI各5 μL混勻后室溫避光孵育20 min，后用PBS洗滌2遍，低速離心收集細(xì)胞，并用150 μL PBS重懸，立即用流式細(xì)胞檢測(cè)儀上樣檢測(cè)各組心肌細(xì)胞H/R后的凋亡率變化。

1.2.5 Western-blot檢測(cè)TrkB、Bcl-2及Bax表達(dá)收集各組處理并培養(yǎng)結(jié)束的H9c2心肌細(xì)胞，PBS洗滌1次后，利用RIPA強(qiáng)細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞中總蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞中總蛋白濃度。取每組中30 μg總蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉30 min后，分別孵育多克隆兔抗鼠TrkB、Akt、p-Akt及內(nèi)參β-actin一抗（均1∶1 000稀釋）于4℃過夜，后TBST洗滌3次，再分別孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）2 h，TBST洗滌3次后，PVDF膜用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，并放入凝膠掃描系統(tǒng)曝光拍照。運(yùn)用Quantity One軟件計(jì)算分析各目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用Turkey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷細(xì)胞存活率的影響MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度BDNF預(yù)處理能夠提高H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后的細(xì)胞存活率，與Control組相比，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的存活率明顯下降（P＜0.05）；而經(jīng)1、10、100 μg/L BDNF+H/R組，細(xì)胞存活率與H/R組相比均上升（均P＜0.05），并具有濃度效應(yīng)；TrkB inhibitor組細(xì)胞存活率低于100 μg/L BDNF+H/R組（P＜0.05），見表1。

2.2 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷CK、LDH、MDA及SOD含量的影響與Control組相比，H/R組H9c2心肌細(xì)胞中CK、LDH漏出量和MDA含量均顯著增加，而SOD活性明顯下降（均P＜0.05）；與H/R組相比，1、10、100 μg/L BDNF+H/R組，除1 μg/L BDNF+H/R外各組的CK漏出量，各組的LDH漏出量和MDA含量均顯著下降，SOD活性均顯著上升（P＜0.05）；與100 μg/L BDNF+H/R組比較，TrkB inhibitor組CK、LDH漏出量和MDA含量增高，SOD活性降低（P＜0.05），但與H/R組相比無(wú)明顯變化，見表2。

Tab.1The effects of BDNF pre-treatment on the survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury表1 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率的影響（n=6，%）

Tab.1The effects of BDNF pre-treatment on the survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury表1 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率的影響（n=6，%）

**P＜0.01；a與Control組比較，b與H/R組比較，c與100 μg/L BDNF+H/R組比較，P＜0.05；表2、3同

組別C o n t r o l組H / R組1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F細(xì)胞存活率1 0 1 . 2 3 ± 1 . 3 3 5 2 . 4 6 ± 3 . 3 3 a 6 7 . 4 3 ± 2 . 8 9 b 7 5 . 5 4 ± 3 . 2 9 b 8 8 . 5 6 ± 4 . 2 3 b 5 7 . 9 2 ± 4 . 2 4 c 3 3 . 5 7 1 * *細(xì)胞凋亡率7 . 6 9 ± 1 . 4 6 4 1 . 9 4 ± 2 . 5 6 a 3 2 . 2 4 ± 2 . 5 2 b 2 2 . 3 7 ± 2 . 9 8 b 1 6 . 3 7 ± 2 . 5 4 b 4 6 . 4 3 ± 3 . 9 6 c 2 4 . 5 2 0 * *

Tab.2The effects of BDNF pre-treatment on the CK，LDH，MDA and SOD levels of H9c2 myocardial cells after H/R injury表2 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后CK、LDH、MDA及SOD含量的影響（n=6）

Tab.2The effects of BDNF pre-treatment on the CK，LDH，MDA and SOD levels of H9c2 myocardial cells after H/R injury表2 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后CK、LDH、MDA及SOD含量的影響（n=6）

組別C o n t r o l組H / R組C 0 1 1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F K（U / m L）. 7 9 ± 0 . 1 2 . 6 9 ± 0 . 2 2 a 1 . 3 3 ± 0 . 1 4 1 . 1 4 ± 0 . 1 9 b 0 . 8 9 ± 0 . 2 1 b 1 . 8 7 ± 0 . 1 8 c 8 . 3 3 3 * * L D H（U / m L）0 . 1 8 ± 0 . 0 4 0 . 7 6 ± 0 . 0 3 a 0 . 6 1 ± 0 . 0 4 b 0 . 4 6 ± 0 . 0 5 b 0 . 3 3 ± 0 . 0 4 b 0 . 6 8 ± 0 . 0 4 c 1 9 . 5 8 8 * *組別C o n t r o l組H / R組1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F M D A（m m o l / g p r o）2 . 4 7 ± 0 . 7 9 8 . 1 0 ± 1 . 1 5 a 6 . 5 9 ± 0 . 6 6 b 5 . 4 7 ± 0 . 4 8 b 4 . 1 2 ± 0 . 8 8 b 7 . 4 4 ± 0 . 9 2 c 1 1 . 5 5 9 * * S O D（U / m g p r o）1 6 3 . 4 8 ± 1 0 . 2 3 4 4 . 3 1 ± 1 3 . 4 8 a 7 6 . 4 5 ± 8 . 9 4 b 1 0 2 . 5 2 ± 6 . 9 7 b 1 4 3 . 5 8 ± 7 . 5 9 b 5 5 . 6 8 ± 9 . 2 2 c 2 9 . 8 9 3 * *

2.3 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷細(xì)胞凋亡率的影響與Control組相比，H9c2心肌細(xì)胞

H/R后細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與H/R組相比，1、10、100 μg/L BDNF+H/R組，細(xì)胞凋亡率卻逐漸降低（均P＜0.05）；TrkBinhibitor和100μg/L的BDNF同時(shí)作用后H/R，細(xì)胞凋亡率未見明顯下降，但明顯高于100μg/LBDNF+H/R組（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 The cell apoptosis of H9c2 myocardial cells tested by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞凋亡

2.4 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷細(xì)胞TrkB、Bcl-2及Bax表達(dá)的影響與Control組相比，H/R組TrkB表達(dá)未見明顯變化，Bcl-2表達(dá)明顯下降，Bax表達(dá)明顯升高（均P＜0.05）；1、10、100 μg/L BDNF預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞后H/R，TrkB、Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降（均P＜0.05）；與100 μg/L BDNF+H/R組比較，TrkB inhibitor組TrkB、Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2The expression of TrkB，Bcl-2 and Bax tested by Western blot assay圖2 Western-blot檢測(cè)TrkB、Bcl-2和Bax表達(dá)

Tab.3The effects of BDNF pre-treatment on expressions of TrkB，Bcl-2 and Bax protein in H9c2 myocardial cells after H/R injury表3 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后TrkB、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響（n=6，）

Tab.3The effects of BDNF pre-treatment on expressions of TrkB，Bcl-2 and Bax protein in H9c2 myocardial cells after H/R injury表3 BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后TrkB、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響（n=6，）

組別C o n t r o l組H / R組1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F T r k B / β -a c t i n 0 . 2 8 ± 0 . 0 4 0 . 2 5 ± 0 . 0 3 0 . 4 7 ± 0 . 0 5 b 0 . 7 5 ± 0 . 0 5 b 0 . 8 8 ± 0 . 0 4 b 0 . 3 3 ± 0 . 0 6 c 5 . 2 3 5 * * B c l -2 / β -a c t i n 0 . 6 8 ± 0 . 0 4 0 . 2 6 ± 0 . 0 3 a 0 . 3 5 ± 0 . 0 3 b 0 . 4 7 ± 0 . 0 4 b 0 . 6 4 ± 0 . 0 5 b 0 . 3 8 ± 0 . 0 4 c 9 . 2 5 3 * * B a x / β -a c t i n 0 . 1 7 ± 0 . 0 3 0 . 5 2 ± 0 . 0 4 a 0 . 3 8 ± 0 . 0 3 b 0 . 2 5 ± 0 . 0 4 b 0 . 1 5 ± 0 . 0 5 b 0 . 5 4 ± 0 . 0 4 c 1 1 . 5 5 5 * *

3 討論

缺血性心臟病是心血管系統(tǒng)中發(fā)病率及死亡率較高的疾病，臨床上多開展血管成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈介入術(shù)等進(jìn)行治療，但恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流灌注后，常引發(fā)心肌組織I/R損傷［6］。因此，如何有效保護(hù)缺血心肌細(xì)胞，減輕心肌細(xì)胞I/R損傷是目前研究的重點(diǎn)。近年研究表明BDNF能夠在心肌損傷后改善心肌微循環(huán)方面起到重要作用［7］，但其具體機(jī)制及能否在心肌組織I/R損傷修復(fù)保護(hù)中發(fā)揮作用尚未知。有研究顯示I/R觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，是I/R損傷的主要原因之一［8］。本研究利用H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建H/R損傷模型模擬心肌缺血再灌注，研究發(fā)現(xiàn)BDNF預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞后H/R能夠提高其細(xì)胞存活率并具有濃度效應(yīng)，說明BDNF預(yù)處理能夠減輕心肌細(xì)胞H/R損傷。

目前認(rèn)為，心肌組織I/R損傷與其抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)受損有關(guān)，I/R過程誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生使細(xì)胞中過氧化物增多，可使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，甚至發(fā)生凋亡［9］。CK作為心肌細(xì)胞胞內(nèi)酶，其漏出量反映心肌細(xì)胞受損程度［10］，而LDH也可作為心肌細(xì)胞受損傷的指標(biāo)，反映細(xì)胞功能變化和細(xì)胞膜的受損程度［11］。本研究中H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后，CK和LDH漏出量均明顯增加，說明H/R能夠損傷心肌細(xì)胞，影響細(xì)胞功能和膜結(jié)構(gòu)完整性。當(dāng)BDNF預(yù)處理后H/R，細(xì)胞內(nèi)CK、LDH漏出量均降低，說明BDNF能夠?qū)9c2心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并維持H/R損傷后心肌細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)完整性和功能。MDA作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，能夠反映心肌細(xì)胞受氧自由基損傷的程度，而SOD作為抗氧化酶，其活性高低反映機(jī)體抗氧化能力［12］。本研究中H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷后，細(xì)胞中MDA含量上升而SOD活性下降，表明心肌細(xì)胞H/R損傷后其抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重受損導(dǎo)致抗氧化能力下降。而不同濃度

BDNF預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞后再H/R，細(xì)胞內(nèi)MDA含量能夠逐漸下降，SOD活性逐漸上升，說明BDNF能夠通過提升心肌細(xì)胞抗氧化和清除氧自由基的能力以減輕H/R損傷。

在對(duì)離體灌流大鼠心臟組織研究中發(fā)現(xiàn)，再灌注早期會(huì)發(fā)生心肌細(xì)胞的凋亡，而Bcl-2和Bax參與心肌細(xì)胞凋亡［13］。本研究顯示BDNF預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞后H/R，細(xì)胞凋亡率明顯降低，即BDNF預(yù)處理能夠通過降低細(xì)胞凋亡率，減輕H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷，同時(shí)BDNF預(yù)處理后H/R，H9c2心肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降，說明BDNF預(yù)處理可通過調(diào)控Bcl-2和Bax表達(dá)發(fā)揮降低H/R損傷后凋亡的作用。TrkB是BDNF的功能性受體，BDNF和TrkB結(jié)合后，受體通過二聚體化及胞內(nèi)激酶特異性酪氨酸磷酸化而激活，介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮各種生理作用［14］。BDNF-TrkB通路不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用，而且能夠介導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和存活，在心肌血管新生過程中扮演重要角色［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著BDNF預(yù)處理濃度的升高，H/R后H9c2心肌細(xì)胞中TrkB的表達(dá)量也隨之升高；當(dāng)高濃度BDNF作用同時(shí)加入TrkB inhibitor，與BDNF單獨(dú)作用組相比，其H/R損傷后細(xì)胞存活率降低，CK、LDH漏出量和MDA含量均升高，而SOD活性降低，且細(xì)胞凋亡率升高，說明BDNF預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷發(fā)揮的作用可能通過與TrkB受體結(jié)合激活BDNF-TrkB信號(hào)通路發(fā)揮作用。

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（2015-05-18收稿 2015-07-16修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

BDNF reduces the hypoxia/reoxygenation injury of H9c2 myocardial cells

WANG Shicai，CHEN Taijun，HUANG Meisong，ZHU Shaoming△
Department of Internal Medicine，Shiyan Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine，Shiyan，Hubei 442000，China△

ObjectiveTo investigate the effects of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）pretreatment on H9c2 myocardial hypoxia/reoxygenation（H/R）injury，and explore its mechanism.MethodsThe H9c2 myocardial cells were cul?tured in vitro and（95%O2+5%CO2）oxygen cultured 12 h after（95%N2+5%CO2）hypoxia cultured 4 h to establish the H/R model.The cells were divided into normal control group，H/R group，different concentrations（1，10，100 μg/L）BDNF pre?

brain-derived neurotrophic factor；myocytes，cardiac；cell hypoxia；receptor，trkB；oxidative stress；apop?tosis；hypoxia/reoxygenation injury

R363

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.011

湖北省十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)科（郵編442000）

王詩(shī)才（1971），男，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病病理基礎(chǔ)與臨床研究

△通訊作者E-mail：zhusaoming@163.com

treatment in H/R groups and TrkB-inhibitor group（with 100 μg/L BDNF and 1∶1 000 TrkB inhibitor pre-treatment in H/R group）.The cell survival rate was measured by MTT method in different groups.The lactate dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK），malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）content and activity were detected after H/R injury. The apoptotic rate of H9c2 myocardial cells were detected by flow cytometry，and the expressions of TrkB，Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot assay.ResultsCompared with the normal control group，the survival rate of H9c2 myocardial cells was decreased significantly in H/R model group（P＜0.05），LDH，CK and MDA contents were increased and SOD activity was decreased（P＜0.05）.The cell apoptosis rate was increased significantly（P＜0.05）.The anti-apoptosis Bcl-2 protein expression was decreased，pro-apoptosis Bax protein expression was increased in H/R model group（P＜0.05）. Compared with the H/R model group，the cell survival rates of H9c2 myocardial cells were increased after pre-treatment with different concentrations of BDNF（P＜0.05）；LDH，CK and MDA contents were decreased and SOD activity were in?creased respectively（P＜0.05）.The cell apoptotic rates were decreased（P＜0.05）.The expressions of TrkB receptor and Bcl-2 protein gradually increased，while the expression of Bax protein was gradually decreased（P＜0.05）.The role of BDNF was inhibited by TrkB inhibitor.ConclusionBDNF pre-treatment can promote the cell survival rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury，which plays a protective role by inhibiting the cell apoptotic rate and maintaining antioxidant capacity，and associates with BDNF-TrkB signaling pathways.