蘆碧含，張文雯，石文艷，馬克濤，李麗，郭淑霞，司軍強(qiáng)

流行病學(xué)調(diào)查

新疆哈薩克、漢族原發(fā)性高血壓與Cx37基因多態(tài)性相關(guān)性研究

蘆碧含，張文雯，石文艷，馬克濤，李麗，郭淑霞，司軍強(qiáng)△

目的探討新疆哈薩克族（哈族）、漢族人群縫隙連接蛋白（Cx）37基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓（EHT）的相關(guān)性。方法新疆地區(qū)EHT患者（EHT組）500例，哈、漢族各250例；同期健康體檢者（NT組）500例，其中哈、漢族各250例。比較2族EHT組與NT組人群年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）及舒張壓（DBP）等一般臨床特征情況。Cx37基因rs1630310、rs697372、rs705193的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)基因多態(tài)性，對(duì)疾病人群進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，計(jì)算各組哈族和漢族各位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率差異。結(jié)果哈族、漢族EHT組與NT組BMI、SBP、DBP、載脂蛋白比值及同型半胱氨酸差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EHT組與NT組rs705193位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。哈族rs1630310位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；哈族rs697372位點(diǎn)基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），漢族2組rs1630310、rs697372位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Cx37基因多態(tài)性與新疆哈族EHT的發(fā)生有關(guān)，rs1630310及rs697372位點(diǎn)多態(tài)性可能與哈族EHT的發(fā)生有關(guān)。

連接蛋白類；基因型；多態(tài)性，單核苷酸；人種群；漢族；原發(fā)性高血壓；哈薩克族；縫隙連接蛋白37；rs1630310；rs697372；rs705193

原發(fā)性高血壓（essential hypertertension，EHT）是遺傳易感性和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病，受基因-基因、基因-環(huán)境間相互作用的影響［1］。血管壁之間的縫隙連接（gap junction，GJ）在血管舒縮反應(yīng)和血管張力調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用?？p隙連接蛋白（connexin，Cx）類型及含量的改變能夠影響EHT的發(fā)?。?］。最近研究認(rèn)為，Cx37基因1019C/T多態(tài)性與EHT密切相關(guān)［3］。但關(guān)于Cx37基因rs1630310、rs697372及rs705193的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)的多態(tài)性與EHT關(guān)系的研究少見。新疆哈薩克族（哈族）是EHT的高發(fā)民族之一。本研究旨在探討新疆哈、漢族Cx37基因rs1630310、rs697372、rs705193多態(tài)性與EHT的關(guān)系，為EHT的預(yù)防、早期診斷及個(gè)性化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料（1）研究對(duì)象。選取2012年10月—2013年12月新疆東灣縣、博爾通古鄉(xiāng)及喀什地區(qū)伽師縣EHT患者（EHT組）500例，哈族、漢族各250例；同期健康體檢者（NT組）500例，哈族、漢族各250例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡30～75歲，在本地居住≥3代，非一、二級(jí)親屬，無(wú)異族通婚史。②符合2010年《中國(guó)高血壓防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)。在未使用抗高血壓藥的情況下，經(jīng)非同日（一般間隔2周）3次測(cè)量取均值，收縮壓（SBP）≥140 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或）舒張壓（DBP）≤90 mmHg；NT組SBP＜140 mmHg和DBP＜90 mmHg。排除繼發(fā)性高血壓以及其他心血管疾病。所有研究對(duì)象均同意參加本研究并簽署知情同意書。（2）儀器與試劑。全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Veriti-384孔多任務(wù)梯度PCR儀（美國(guó)ABI公司）；納升點(diǎn)樣儀、質(zhì)譜微陣列芯片、TOF-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)SEQUENOM公司）。

1.2 方法

1.2.1 一般資料比較2組均于石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科抽取外周靜脈全血4 mL，肝素鈉抗凝，分離血漿，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等常規(guī)血液生化指標(biāo)。比較哈、漢族EHT組與NT組生化指標(biāo)等一般臨床特征情況。

1.2.2 靜脈血白細(xì)胞DNA提取抽取所有哈、漢族研究對(duì)象的外周靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中-80℃保存。使用DNA提取試劑盒提取DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳判定其質(zhì)量，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)采用SEQUENOM公司Assay Designer 3.1軟件包設(shè)計(jì)擴(kuò)增、延伸引物，每個(gè)SNP對(duì)應(yīng)2條PCR擴(kuò)增引物和一條延伸引物，見表1。引物由北京天根生化科技有限公司合成。

1.2.4 SNP等位基因分型將DNA樣本稀釋到10 μg/L，取1 μL DNA樣本，與0.95 μL水、0.5 μL 10×PCR緩沖液、0.4 μL MgCl2、0.1 μL dNTP、0.2 μL PCR酶、1.35 μL PCR引物混合，在384孔板常規(guī)擴(kuò)增待測(cè)片段。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃3 min。在PCR產(chǎn)物中加入10×SAP緩沖液0.17 μL，SAP酶0.3 μL，于37℃45 min，85℃5 min反應(yīng)后，根據(jù)SEQUENOM程序進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，加入5×iPlex緩沖液0.2 μL、水0.6 μL、iPlex延伸終止物0.2 μL、引物0.94 μL、iPlex酶0.041 μL混合。反應(yīng)條件：94℃30 s；94℃5 s，52℃5 s，80℃1 min，40個(gè)循環(huán)；52℃5 s，80℃1 min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。加入6 mg陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽，混合后補(bǔ)充16 μL蒸餾水，用納升點(diǎn)樣儀將產(chǎn)物分點(diǎn)在質(zhì)譜微陣列芯片上。用Typer4.0軟件編輯相對(duì)應(yīng)的引物和樣本，并按順序讀取對(duì)應(yīng)的SNP分型數(shù)據(jù)。對(duì)NT人群進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，計(jì)算各組哈族和漢族各位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)，使用M（P25，P75）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1Cx37 gene SNP locus primers and extension primer sequences表1 Cx37基因SNP位點(diǎn)擴(kuò)增引物及延伸引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同民族EHT組與NT組一般臨床特征的比較EHT組與NT組哈族、漢族人的體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、SBP、DBP、載脂蛋白比值及同型半胱氨酸水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、3。

2.2 SNP等位基因質(zhì)譜分型結(jié)果Cx37基因rs1630310、rs697372和rs705193位點(diǎn)都具有A和G 2種等位基因，AA、AG、GG 3種基因型，見圖1。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)哈族NT組Cx37基因rs1630310、rs705193、rs697372位點(diǎn)基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（χ2分別為1.349、0.003及0.001，均P＞0.05）。漢族NT組Cx37基因rs1630310、rs705193、rs697372位點(diǎn)基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（χ2分別為0.001、0.131及0.380，均P＞0.05），在遺傳學(xué)上有較好的群體代表性。

Tab.2Comparison of clinical data between Kazak EHT and NT groups表2 哈族EHT與NT組一般資料比較［n=250，M（P25，P75）］

Tab.3Comparison of clinical data between Han EHT and NT groups表3 漢族EHT與NT組一般資料比較［n=250，M（P25，P75）］

Fig.1rs1630310 locus genotypes of different peak times of flight mass spectrometry figure圖1 rs1630310位點(diǎn)不同基因型的飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)峰值圖

2.4 不同民族Cx37基因SNP基因型及等位基因頻率與EHT的關(guān)系哈族人群EHT組與NT組rs705193位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；rs1630310位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；rs697372位點(diǎn)基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。漢族人群2組間3個(gè)位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表4、5。

Tab.4The relationship between genotype and allele frequency of Cx37 gene rs1630310，rs697372 and rs705193 with EHT in Kazak group表4 哈族Cx37基因rs1630310、rs697372和rs705193位點(diǎn)基因型及其等位基因頻率分布與EHT的關(guān)系

3 討論

EHT疾病受多重因素影響。生化檢測(cè)結(jié)果顯示，EHT組載脂蛋白比值、同型半胱氨酸含量高于NT組，此與張蕾等［4］研究相一致。哈族rs1630310

基因位點(diǎn)的基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)意義，提示該基因頻率的改變可能與新疆哈族EHT的發(fā)病相關(guān)；漢族EHT組Cx37基因rs1630310、rs697372、rs705193的SNP位點(diǎn)的基因頻率與NT組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，據(jù)此筆者推測(cè)rs1630310基因位點(diǎn)的基因分布在人群中的表達(dá)可能存在種族特異性。哈族2組rs697372位點(diǎn)的基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示哈族rs697372位點(diǎn)等位基因分布與EHT的發(fā)生可能存在一定的關(guān)聯(lián)。

Tab.5The relationship between genotype and allele frequency of Cx37 gene rs1630310，rs697372 and rs705193 with EHT in Han group表5 漢族Cx37基因rs1630310、rs697372和rs705193位點(diǎn)基因型及其等位基因頻率分布與EHT的關(guān)系

研究顯示，遺傳因素在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用［5］。Cx37基因位于1號(hào)染色體1p35.1位點(diǎn)，由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子構(gòu)成，序列長(zhǎng)度為2 750 bp［6］。Cx37是一種細(xì)胞間通訊相關(guān)的蛋白，并且是至今被認(rèn)定少數(shù)幾種與瓣膜［7］、冠心?。?］、動(dòng)脈粥樣硬化［9］密切相關(guān)的縫隙連接蛋白。鼠腎素依賴性高血壓模型結(jié)果研究顯示，鼠大動(dòng)脈平滑肌Cx37蛋白的表達(dá)有所增加，并且可參與上調(diào)eNOS的磷酸化水平，從而增加NO的釋放，最終影響內(nèi)皮以及平滑肌細(xì)胞血流動(dòng)力學(xué)［10］。但對(duì)于Cx37參與人類EHT發(fā)病機(jī)制尚不清楚，推斷可能原因有：（1）細(xì)胞間通過構(gòu)成Cx37/Cx37同型GJ，或Cx37與其他Cxs構(gòu)成異型GJ，進(jìn)而介導(dǎo)血管收縮物質(zhì)，如血管緊張素、腎上腺素、Ca2+等運(yùn)輸，起到調(diào)節(jié)血管舒縮活動(dòng)作用。（2）Cx37分布于小動(dòng)脈阻力性血管，調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性的血管緊張活動(dòng)，從而影響EHT的發(fā)生發(fā)展［11］。本研究結(jié)果顯示，哈族人群EHT組Cx37基因rs1630310位點(diǎn)基因型以及基因頻率與NT組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明哈族人群EHT的發(fā)病與可能Cx37基因相關(guān)，正常的血管緊張度和血壓的維持有賴于血管舒張和收縮反應(yīng)的平衡，一旦平衡被打破將對(duì)血壓及組織灌注產(chǎn)生影響。由于Cx37介導(dǎo)的細(xì)胞通訊參與血管舒縮運(yùn)動(dòng)的復(fù)雜調(diào)節(jié)，而Cx基因位點(diǎn)基因頻率的不同可使GJ的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生不同程度的變化，從而導(dǎo)致血管緊張度平衡的破壞［12］，最終導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。

綜上所述，種族、地區(qū)及環(huán)境等因素導(dǎo)致基因多態(tài)性，使EHT產(chǎn)生種族及地域差異性；Cx37蛋白基因與新疆哈族EHT的發(fā)生有關(guān)，Cx37的結(jié)構(gòu)及功能的變化可能導(dǎo)致EHT的發(fā)生。但是，Cx37及多態(tài)性在EHT中的具體作用機(jī)制和影響有待進(jìn)一步深入研究。

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（2015-02-13收稿 2015-04-01修回）

（本文編輯 陸榮展）

Relationship between the Cx37 polymorphism of connexin gene and essential hypertension in Kazak and Han population in Xinjiang

LU Bihan，ZHANG Wenwen，SHI Wenyan，MA Ketao，LI Li，GUO Shuxia，SI Junqiang△
Department of Physiology，School of Medicine Shihezi University，Shihezi 832000，China△

ObjectiveTo investigate the association of the Cx37 polymorphism of connexin gene with essential hyper?tension（EHT）in Xinjiang Han and Kazak population.MethodsIn Xinjiang region，500 EHT patients（EHT group）were in?cluded in this study including Kazak 250 cases and Han 250 cases.Five hundred healthy volunteers（NT）were used as NT group including Kazak 250 cases and Han 250 cases.The values of age，body mass index（BMI），systolic blood pressure（SBP）and diastolic blood pressure（DBP），and other general clinical features were compared between two groups.The poly?morphism of Cx37 gene rs1630310，rs697372 and rs705193 SNP were compared between EHT and NT groups in the two eth?nic groups.Hardy-Weinberg equilibrium was used to detect the representation，and differences of genotype frequencies and gene frequency were calculated in two groups of Kazak and Han groups.ResultsThere were significant differences in BMI，SBP，DBP，apolipoprotein ratios and homocysteine between EHT group and NT group in Kazak and Han groups（P＜0.05）. There were no significant differences in genotype frequencies and gene frequencies of rs705193 between EHT and NT groups（P＞0.05）.The differences of Kazak rs1630310 genotype and gene frequency were statistically significant（P＜0.01）. The frequency of Kazak rs697372 locus genotype was not significantly different（P＞0.05），but the difference of gene frequen?cy was statistically significant（P＜0.05）.There were no significant differences in rs1630310 and rs697372 locus genotype and gene frequency in two groups of Han group.ConclusionCx37 gene polymorphism is associated with the occurrence of EHT in Xinjiang Kazak population，which may be related with the rs1630310 and rs697372 polymorphism.

connexins；genotype；polymorphism，single nucleotide；ethnic groups；Han Nationlity；essential hyperterten?sion；Kazak；Cx37；rs1630310；rs697372；rs705193

R544.11；R394.11

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.028

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2012CB26600）；兵團(tuán)博士基金項(xiàng)目（2010JC16）；兵團(tuán)醫(yī)藥專項(xiàng)（2012BA021，2010GG34）

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編832000）

蘆碧含（1988），女，研究生，主要從事血管生理學(xué)研究

△通訊作者E-mail:sijunqiang@shzu.edu.cn