王孟軍
重組人胸腺肽α1研究進(jìn)展
王孟軍
胸腺肽 α1(thymosin α1)是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的小分子活性多肽,已廣泛應(yīng)用于臨床,主要用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷癥,如慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、抗病毒、治療 AIDS等,并用作各種惡性腫瘤前期化療、放療的輔助用藥[1-3]。
胸腺肽 α1的生產(chǎn)技術(shù)經(jīng)歷了生物提取、固相合成等技術(shù)發(fā)展過程,目前主要采用固相合成法生產(chǎn),雖然與生物提取法相比在質(zhì)量、成本等方面有較大優(yōu)勢,但仍然沒有解決工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等問題。通過查詢各種公開資料及匯總分析各種方法、技術(shù)狀況,發(fā)現(xiàn)采用基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)重組人胸腺肽 α1成為當(dāng)前研發(fā)的熱點,且首個重組人胸腺肽α1藥品即將獲批上市,顯示該技術(shù)具有較好的競爭優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿?,將成為今后胸腺?α1技術(shù)發(fā)展的主要方向。
Goldstein等[4]在 20世紀(jì) 70年代末期從胸腺生成素第 5組分(TF5)中分離純化出一種小分子生物活性多肽,具有胸腺肽類似的生物活性,命名為胸腺肽 α1。它由 28個氨基酸組成,等電點為 4.2,相對分子量 3108,結(jié)構(gòu)式為:Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。
目前生產(chǎn)胸腺肽 α1的技術(shù)有生物提取法和固相合成法,生物提取法是以新鮮小牛胸腺組織為原料,采用凍融和離子色譜法提純獲得胸腺肽 α1,固相合成法主要采用Wang樹脂等為起點,逐個添加氨基酸延伸肽鏈長度合成胸腺肽 α1。
生物提取法以動物組織為原料,受原料來源及新鮮程度等影響,收率和質(zhì)量不易控制。曹強(qiáng)庚等[5]認(rèn)為不同年齡的牛胸腺組織中胸腺肽含量存在很大差別,剛出生的乳牛胸腺肽含量最高,而材料的新鮮程度也對胸腺肽的質(zhì)量和收率有較大影響。盡管生物提取法通過改進(jìn)工藝而不斷提高收率,但是胸腺肽在胸腺組織中的含量很低(<1%)[6],其有效成分胸腺肽 α1在市售胸腺肽粗粉中的含量也僅為 0.6%~1%。因此,原料來源少和收率低是生物提取法制備胸腺肽α1的最大限制因素。
固相合成法可生產(chǎn)純度很高的胸腺肽 α1,如劉標(biāo)和湯斌[7]采用反相離子對液相色譜法,通過多步分離純化獲得純度達(dá) 99.5%的胸腺肽 α1產(chǎn)品。但由于合成步驟多,周期長,條件苛刻,獲得高純度的產(chǎn)品需要多步純化,造成總收率偏低,成本偏高,而大量使用的溶媒會污染環(huán)境,進(jìn)一步增加了產(chǎn)品成本。因此,合成法生產(chǎn)技術(shù)關(guān)鍵是要減少反應(yīng)步驟,采用更為溫和的反應(yīng)條件,如能將催化劑用于固相合成反應(yīng),尤其是各種生物酶,或?qū)⒍鄠€小肽鏈縮合反應(yīng)生成多肽的“多肽片段鏈接法”[8]等技術(shù)應(yīng)用于胸腺肽 α1的合成中,將會有很好的效果。
現(xiàn)有的生物提取法和固相合成法生產(chǎn)胸腺肽 α1因受到原料、技術(shù)、環(huán)境保護(hù)等因素影響,其生產(chǎn)成本居高不下,市場售價偏高,如 1.6 mg/支商品名為“日達(dá)仙”的注射用胸腺肽 α1藥品售價高于 700元,因此有必要尋求新的解決途徑。
多肽類物質(zhì)來源于生物有機(jī)體,利用基因重組技術(shù)將目的基因整合到宿主中,使其具備表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物的能力,通過發(fā)酵方法可以獲得大量的目標(biāo)產(chǎn)物。經(jīng)過研究者的不懈努力,重組人胸腺肽 α1的技術(shù)已經(jīng)日漸成熟,首個產(chǎn)品即將上市[9],將成為極有力的競爭者。
2.1 基因工程菌的構(gòu)建技術(shù)
胸腺肽 α1是由 28個氨基酸組成的小分子多肽,選擇合適的目的基因載體和宿主是獲得有效表達(dá)胸腺肽 α1基因工程菌的關(guān)鍵。歸納已有文獻(xiàn)資料報道,目前基因工程菌的構(gòu)建主要有以下三種方式。
2.1.1 多串體基因 Xue等[10]利用隨機(jī)退火與 PCR技術(shù)相結(jié)合的方法構(gòu)建了胸腺素 α1的多串體基因,并成功克隆到大腸桿菌中;東北制藥集團(tuán)股份有限公司采用雙酶切方法將胸腺肽 α1四串體基因克隆至 pGEX-4T-2質(zhì)粒相應(yīng)位點,構(gòu)建融合表達(dá)載體 pGEX-4T-2-4Tα1,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到基因工程菌,在 IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)[11]。
2.1.2 融合蛋白 Zhang等[12]構(gòu)建了 hTα1-histag融合蛋白,在大腸埃希菌 BL21中獲得表達(dá);陳培富等[13]將人工合成的人胸腺肽 α1基因插入到載體 pBV222,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α菌株中,置 42℃ 誘導(dǎo)表達(dá)含胸腺肽 α1的可溶性融合蛋白;劉中祿等[14]將人工合成的胸腺肽 α1基因序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和酶切后,用T4DNA快速連接酶連接構(gòu)建 pMAL-C2x-Tα1融合表達(dá)質(zhì)粒,將重組體轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌 TB1菌中,成功構(gòu)建了 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌;深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司將人工合成的融合蛋白基因重組到載體質(zhì)粒 pet-22b中,將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌成功構(gòu)建了工程菌[15];Lao等[16]為了增強(qiáng)胸腺肽 α1在抗腫瘤治療中的藥效,將合成 Tα1-iRGD基因序列插入到載體pET32a,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3),使胸腺肽 α1與腫瘤穿透肽 iRGD融合表達(dá)。
此兩種方法是將胸腺肽 α1肽鏈人為擴(kuò)充,使其易于克隆到宿主細(xì)胞中并能有效表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物,但產(chǎn)物是以融合蛋白形式存在,需要進(jìn)行酶切等后續(xù)處理才能獲得單一的胸腺肽 α1。
2.1.3 單體基因 長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體 oSTII/Tα1,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli W3110)使之成為工程菌,然后進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng),目標(biāo)產(chǎn)物以單一組分分泌在細(xì)胞間質(zhì)中[17];熊燕燕和湯斌[18]將人工合成的胸腺肽 α1單體基因連接到 pPIC9K質(zhì)粒上,構(gòu)建表達(dá)載體 pPIC9K-Tα1,整合到畢赤酵母中,目標(biāo)產(chǎn)物直接分泌到發(fā)酵液中,相比于融合表達(dá),大大簡化了后續(xù)產(chǎn)品分離步驟。
比較以上不同方法可看出,采用多串體基因或融合蛋白方式克服了小分子肽難以表達(dá)的難題,構(gòu)建了有效表達(dá)胸腺肽 α1的工程菌,但因表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,需要進(jìn)行細(xì)胞破壁釋放,在后續(xù)純化時需要進(jìn)行酶切等處理,增加了技術(shù)難度和成本。然而,采用與腫瘤穿透肽等蛋白結(jié)合進(jìn)行融合表達(dá),使其具備新的功能,是一個很好的創(chuàng)新思路。相比而言,單體基因技術(shù)具有相對優(yōu)勢,將合成的胸腺肽 α1單體基因與相關(guān)質(zhì)粒結(jié)合,整合到宿主細(xì)胞中,其優(yōu)勢在于可將產(chǎn)生的胸腺肽 α1分泌到發(fā)酵液中,大大降低了后續(xù)處理難度。
2.2 發(fā)酵純化技術(shù)
在成功獲得能表達(dá)胸腺肽 α1工程菌的同時,其發(fā)酵純化技術(shù)也取得了進(jìn)展。因基因工程菌的不同特點,發(fā)酵條件的優(yōu)化和后續(xù)純化又各有特點,目前主要有兩種方式。
采用融合蛋白方式構(gòu)建的工程菌在發(fā)酵時往往需要特定條件進(jìn)行誘導(dǎo),主要以胞內(nèi)產(chǎn)物形式存在,純化時需要破壁及酶切融合蛋白。如深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司將獲得的基因工程菌[E.coli,載體質(zhì)粒pet-22b/BL21(DE3)]在 10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng),經(jīng)分離后每升發(fā)酵液獲得 127.3 g濕菌體,純化過程采用菌體破碎、親和層析、腸激酶水解融合蛋白、離子交換等方法獲得純度大于 98%的重組胸腺肽 α1,折合表達(dá)量約254.6 mg/L[15];劉中祿等[19]將獲得的重組工程菌(E.coli,Tα1/PMAL-C2x/TB1)進(jìn)行發(fā)酵并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白MPB-Tα1,經(jīng)親和層析純化,凝血酶裂解融合蛋白,Source Q離子交換,得到蛋白純度大于 95% 的胸腺肽 α1。
與上述技術(shù)相比,采用單體基因方式獲得的基因工程菌可獲得胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物,其在后續(xù)處理上有較大的優(yōu)勢。如熊燕燕和湯斌[18]采用獲得的含 pPIC9K-Tα1的畢赤酵母進(jìn)行培養(yǎng),將目的蛋白直接分泌到發(fā)酵液中,取發(fā)酵液上清,過 DEAE52、SephadexG-25柱純化后獲得目的蛋白,采用Tricine-SDS-PAGE和 HPLC法分析,表達(dá)量為 4.8 mg/L。
無論以何種方式獲得的重組工程菌,其蛋白表達(dá)水平和后續(xù)的純化技術(shù)將決定其是否具備規(guī)?;a(chǎn)能力,上述方法中構(gòu)建的單體基因重組的畢赤酵母工程菌具有一定的優(yōu)勢,應(yīng)成為今后技術(shù)發(fā)展的方向。由于其將目的蛋白直接分泌到發(fā)酵液中,經(jīng)過 DEAE52和 SephadexG-25兩步純化后可直接得到純度較高的胸腺肽 α1,相比于融合表達(dá),大大簡化了分離步驟,降低了成本,易規(guī)模化生產(chǎn)。
2.3 基因重組技術(shù)成為研發(fā)熱點
隨著生物技術(shù)的發(fā)展,采用基因工程重組技術(shù)獲得胸腺肽 α1逐漸成為研發(fā)熱點,中國專利數(shù)據(jù)庫(http://epub. sipo.gov.cn/)數(shù)據(jù)顯示,與胸腺肽 α1重組技術(shù)相關(guān)的專利有 17項申請(表 1),國內(nèi)已有企業(yè)正在進(jìn)行藥品生產(chǎn)文號報批,重組人胸腺肽 α1技術(shù)有望實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
表1 基因工程重組胸腺肽 α1的相關(guān)專利
2.4 即將產(chǎn)業(yè)化的專利技術(shù)
長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司采用單體基因法構(gòu)建了工程菌(E.coli,oSTII/Tα1/W3110),并在 150 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了高密度培養(yǎng),目標(biāo)產(chǎn)物以單一組分分泌在細(xì)胞間質(zhì)中。發(fā)酵終止后收集菌體,采用低溫、低滲法裂解菌體,使用陰、陽離子交換層析進(jìn)行粗純,SephacrylS-100HR凝膠過濾層析法進(jìn)行精純,獲得了純度大于 98%的重組人胸腺肽 α1,折合每升發(fā)酵液可得到大于 110 mg的純品[17]。
該技術(shù)以酵母粉、葡萄糖等為原料,采用傳統(tǒng)發(fā)酵補(bǔ)料工藝生物合成胸腺肽 α1,其單一組分的純化過程較為簡單,步驟較少,較易獲得高純度產(chǎn)品。由于其具有較高的表達(dá)量、低廉的原材料成本,簡便的操控工藝,易于放大等特點,使工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)成為可能。
1997年美國賽生(Sciclone)公司開發(fā)的胸腺肽 α1獲準(zhǔn)上市,并在 24個國家批準(zhǔn)用于慢性乙型肝炎的治療,在歐、美、日等國家和地區(qū)也用于治療丙型肝炎、肝細(xì)胞癌及免疫疾病。
據(jù)醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報報道,2012年全國 22城市樣本醫(yī)院購入金額領(lǐng)先的 30個品種中,胸腺肽 α1位列第 18位,占比 0.73%[20];2013上半年全國 22城市樣本醫(yī)院購入金額領(lǐng)先的 30個品種中胸腺肽 α1位列第 21位,占0.69%[21],可見胸腺肽 α1是一種應(yīng)用較為廣泛的藥物。
查詢國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)網(wǎng)站(http:// www.sfda.gov.cn/),數(shù)據(jù)顯示國內(nèi)胸腺肽 α1原料藥生產(chǎn)批件有 4個,制劑生產(chǎn)批件有 10個,其中進(jìn)口制劑批件1個;重組人胸腺肽 α1新藥注冊申報有兩家,一家處于生產(chǎn)報批階段,另一家處于臨床研究階段。
基因工程重組技術(shù)解決了獲得高效表達(dá)胸腺肽 α1工程菌的難題,隨著生物技術(shù)上下游工藝水平的不斷提高,重組人胸腺肽 α1技術(shù)有望實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。2013年長春高新[9]已完成注射用重組人胸腺素 α1的臨床研究,獲批上市后將成為首個采用基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)的胸腺肽 α1產(chǎn)品。深圳海王藥業(yè)有限公司研制的注射用重組人胸腺肽 α1于2009年 7月獲得臨床批件,目前正處于 II期臨床試驗中。
胸腺肽 α1是一種臨床應(yīng)用較廣的免疫調(diào)節(jié)劑,其在調(diào)節(jié)人體自身免疫能力,促使患者免疫平衡方面有很好的作用,廣泛用于自身免疫性疾病及腫瘤的防治。據(jù)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會 2013年公布的數(shù)據(jù)表明中國有近 1億乙肝病毒攜帶者[22],《2012中國腫瘤登記年報》數(shù)據(jù)顯示 2009年全國新發(fā)腫瘤病例為 312萬例,腫瘤死亡率為 180.5/10萬,腫瘤防治形勢不容樂觀[23]。由于肝炎患者、癌癥患者的數(shù)量龐大且發(fā)病率不斷升高,預(yù)測免疫調(diào)節(jié)劑類藥物市場需求仍將平穩(wěn)增長。目前,固相合成仍是生產(chǎn)胸腺肽 α1的主要生產(chǎn)技術(shù),基因工程重組技術(shù)正在成為新的研發(fā)熱點。在眾多開發(fā)的基因重組技術(shù)中,采用單體基因構(gòu)建工程菌是一種有競爭力的技術(shù),有望成為重組人胸腺肽 α1的主要技術(shù)發(fā)展方向。隨著首個重組人胸腺肽 α1藥品的上市,將會起到導(dǎo)向作用,從而促進(jìn)技術(shù)水平不斷提高,為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)提供有力條件。
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