周海英，許云敏，余麗萍，杜 艷，單 斌，陳正輝，邵天波，陳瑞春

重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）是醫(yī)院感染高發(fā)病區(qū)，而新生兒ICU（NICU）因患兒年齡小，起病急、病情變化快，其特異性和非特異性免疫功能尚不成熟，抵抗力差，如果再并發(fā)醫(yī)院感染，將直接危及到患兒的生命，因此控制醫(yī)院感染，對(duì)提高新生兒存活率顯得尤為重要。連續(xù)性耐藥監(jiān)測(cè)對(duì)臨床用藥具有重要意義，可以指導(dǎo)和幫助臨床合理選擇抗菌藥物，并可及時(shí)發(fā)現(xiàn)病房?jī)?nèi)細(xì)菌耐藥暴發(fā)流行的狀況，早期發(fā)現(xiàn)耐藥因素，為制定抗菌藥物使用指南提供依據(jù)［1-2］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源與分離鑒定 收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010—2013 年NICU 分離出的648株腸桿菌科細(xì)菌，排除同一患兒同一部位重復(fù)株。

1.1.2 培養(yǎng)基與抗菌藥物紙片 藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基為MH 瓊脂（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。藥敏試驗(yàn)紙片為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品，全自動(dòng)藥敏試驗(yàn)卡片為VITEK-2檢測(cè)系統(tǒng)配套產(chǎn)品（法國(guó)生物梅里埃公司）。受試抗菌藥物見(jiàn)結(jié)果部分表格所列。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定 采用VITEK-2配套GN 卡進(jìn)行細(xì)菌種類的鑒定。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 主要采用VITEK-2 配套藥敏卡進(jìn)行測(cè)定，部分補(bǔ)充的藥物采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853。每周進(jìn)行1次質(zhì)控。

1.2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)計(jì)分析 藥敏試驗(yàn)按CLSI 2012年版標(biāo)準(zhǔn)［3］判斷結(jié)果，采用WHONET5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本分布

4年間標(biāo)本分布基本相同，主要以尿液、呼吸道及血液標(biāo)本為主，平均分別占51.2%（332／648）、30.6%（198／648）、15.1%（98／648），其他標(biāo)本占3.1%。見(jiàn)表1。

表1 2010—2013年送檢標(biāo)本數(shù)的分布Table 1 Distribution of specimen types by year n （%）

2.2 菌株分布

4年間細(xì)菌菌種分布無(wú)明顯改變，主要以大腸埃希菌、克雷伯菌屬（肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌和解鳥(niǎo)氨酸克雷伯菌）和腸桿菌屬（陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌）為主，平均檢出率分別為47.4%（307／648）、38.1%（247／648）、10.3%（67／648），其他腸桿菌科細(xì)菌所占比例4.2%（27／648）。見(jiàn)表2。

2.3 細(xì)菌對(duì)藥物敏感性

總體顯示細(xì)菌對(duì)阿米卡星敏感率最高，平均為95.7%；對(duì)碳青霉烯類抗生素保持較高敏感率，對(duì)美羅培南、厄他培南和亞胺培南的敏感率分別為92.3%、90.9%和87.6%；對(duì)青霉素類、頭孢菌素類抗生素耐藥率較高，除對(duì)頭孢吡肟和頭孢他啶敏感率分別為72.7%、56.2%外，其余均低于30.0%；對(duì)喹諾酮類的敏感率在79.2%～87.1%。連續(xù)監(jiān)測(cè)顯示，所檢測(cè)的抗菌藥物敏感率在2011年均有所下降。對(duì)第三代頭孢菌素的敏感率無(wú)明顯變化，趨于平穩(wěn)，對(duì)頭孢吡肟敏感率有所上升（72.6% 到86.5%）；對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦敏感率逐漸下降，前者從82.8%到61.9%，后者從87.9%到82.1%；對(duì)阿莫西林-克拉維酸敏感率升高（18.4%到51.8%）；喹諾酮類左氧氟沙星敏感率逐漸升高（62.5%到93.1%），總敏感率為87.1%，環(huán)丙沙星總敏感率為79.2%。見(jiàn)表3。

表2 2010—2013年前3位細(xì)菌的檢測(cè)率Table 2 Top three Enterobacteriaceae species and number of strains during the period from2010 to 2013 n （%）

表3 648株腸桿菌科細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of 648 strains of Enterobacteriaceae to antimicrobial agents （%）

2.4 腸桿菌科3個(gè)常見(jiàn)菌種的耐藥變遷

2.4.1 大腸埃希菌 大腸埃希菌307株，占檢出的第1位。對(duì)碳青霉烯類抗生素敏感率最高，其次是阿米卡星，兩者敏感率均大于93.0%；對(duì)頭孢曲松和頭孢噻肟敏感率低于頭孢他啶，對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦敏感率呈下降趨勢(shì)（84.9%降到70.1%），對(duì)哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-克拉維酸的敏感率呈上升趨勢(shì)，分別從89.1%升至97.1%，22.6%升至65.6%，對(duì)其他抗菌藥物敏感率與腸桿菌科總變遷相同。見(jiàn)表4。

表4 2010—2013大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物耐藥率和敏感率Table 4 Susceptibility of Escherichia coli to antimicrobial agents by year from2010 to 2013 （%）

2.4.2 克雷伯菌屬 共分離247株。對(duì)阿米卡星的敏感率與大腸埃希菌相似，保持在94%以上；對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類的敏感率低于大腸埃希菌；對(duì)喹諾酮類敏感率高于大腸埃希菌；對(duì)頭孢曲松和頭孢噻肟敏感率與大腸埃希菌一樣，低于頭孢他啶；對(duì)慶大霉素（從78.9%降到59.4%）、頭孢哌酮-舒巴坦（81.2%降到51.6%）、哌拉西林-他唑巴坦（83.8%降到68.4%）敏感率逐年下降，對(duì)其他抗菌藥物敏感率變遷與腸桿菌科總變遷相同。藥敏結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4.3 腸桿菌屬 共分離67 株。由于2012 和2013年菌株數(shù)少，僅對(duì)2010和2011年菌株進(jìn)行分析。對(duì)阿米卡星、碳青霉烯類的3種抗生素和阿莫西林-克拉維酸敏感率都低于大腸埃希菌和克雷伯菌屬；對(duì)其余大部分抗菌藥物敏感率高于大腸埃希菌和克雷伯菌屬。藥敏結(jié)果見(jiàn)表6。

2.5 產(chǎn)和非產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）株的藥敏結(jié)果

共檢出產(chǎn)ESBL 的菌株277 株，占腸桿菌科42.7%。ESBL檢出率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。大腸埃希菌、克雷伯菌屬中產(chǎn)ESBL 株平均分別為46.3%（142／307）和54.7%（135／247）。產(chǎn)ESBL 的大腸埃希菌對(duì)大部分抗菌藥物的敏感率低于非產(chǎn)ESBL菌株；但克雷伯菌屬產(chǎn)ESBL菌株除對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟及哌拉西林的敏感率低于非產(chǎn)ESBL株外，對(duì)碳青霉烯類，含酶抑制劑類抗菌藥物的敏感率卻高于非產(chǎn)ESBL菌株，其余抗菌藥物未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)表7。

2.6 碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）

在NICU 共分離到產(chǎn)碳青霉烯酶菌株51株，占腸桿菌科細(xì)菌的7.9%。改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性48株，陰性3株?？死撞鷮?7株（72.5%），其中肺炎克雷伯菌33株（64.7%）；腸桿菌屬9株（17.6%），其中陰溝腸桿菌8株（15.7%）；弗勞地枸櫞酸桿菌3株（5.9%）；大腸埃希菌2株（3.9%）。該類菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為83.7%、60.5%、95.3%。對(duì)頭孢菌素類耐藥率較高，除對(duì)第四代頭孢菌素頭孢吡肟耐藥率為61.0%外，其余第一、二、三代頭孢菌素及含酶抑制劑類抗菌藥物的耐藥率均＞90%；對(duì)氨曲南的耐藥率為46.2%，對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥率較低，均＜30%，其中對(duì)阿米卡星的耐藥率僅為2.6%；對(duì)喹諾酮類藥物有較高的體外敏感性，耐藥率＜10%，48株細(xì)菌均未發(fā)現(xiàn)對(duì)左氧氟沙星耐藥。藥敏結(jié)果見(jiàn)表8。

表5 克雷伯菌屬對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 5 Susceptibility of Klebsiellaspp.to antimicrobial agents by year from2010 to 2013 （%）

表6 腸桿菌屬對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 6 Susceptibility of Enterobacter spp.to antimicrobial agents by year from2010 to 2013 （%）

表7 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌和克雷伯菌屬對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 7 Susceptibility of ESBLs（＋）and ESBLs（-）E.coli and Klebsiellaspp.to antimicrobial agents （%）

表8 CRE對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 8 Susceptibility of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains to antimicrobial agents （%）

3 討論

本研究2010—2013 年耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果如下：①NICU 分離到的腸桿菌細(xì)菌主要來(lái)源于泌尿道，其次為呼吸道和血液標(biāo)本。分離細(xì)菌以大腸埃希菌、克雷伯菌屬和腸桿菌屬為主，與國(guó)內(nèi)報(bào)道基本相同［4］。4年間標(biāo)本來(lái)源及常見(jiàn)菌分布基本相同。②腸桿菌科細(xì)菌對(duì)阿米卡星敏感率最高，其次為碳青霉烯類抗生素。各類抗菌藥物對(duì)大腸埃希菌敏感性高于克雷伯菌屬和腸桿菌屬，其原因與產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌細(xì)菌以克雷伯菌屬（肺炎克雷伯菌）和腸桿菌屬（陰溝腸桿菌）為主有關(guān)。除了克雷伯菌屬外，大腸埃希菌和腸桿菌屬對(duì)大部分受試藥物的敏感率高于全國(guó)ICU 的報(bào)道［5］，大腸埃希菌和克雷伯菌屬對(duì)環(huán)丙沙星和慶大霉素的敏感率與王麗等［6］報(bào)道相近；兒童耐藥率低于成人［7］，可能與喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物在NICU 較少應(yīng)用有關(guān)。③產(chǎn)ESBL 菌株檢出率逐年升高，大腸埃希菌和克雷伯菌屬的ESBL 檢出率平均分別為46.3%、54.7%；大腸埃希菌ESBL 檢出率低于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年57.4%以及全國(guó)2012年55.3%水平［4］；而克雷伯菌屬高于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年33.7%和全國(guó)2013年33.9%水平［4］。有研究報(bào)道，兒科ESBL 檢出率高于成人科室［8］。大腸埃希菌產(chǎn)ESBL菌株對(duì)大多數(shù)抗菌藥物的敏感率低于非產(chǎn)ESBL 菌株；但克雷伯菌屬產(chǎn)ESBL菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素的敏感率顯著高于非產(chǎn)ESBL 菌株，這一現(xiàn)象與昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院NICU 中CRE 菌株主要以克雷伯菌屬為主有關(guān)。CRE 的產(chǎn)生是否會(huì)導(dǎo)致儀器對(duì)ESBL 的檢測(cè)發(fā)生了錯(cuò)誤？針對(duì)這一問(wèn)題我們對(duì)43株CRE菌株進(jìn)行了ESBL 表型確證試驗(yàn)，結(jié)果顯示僅有5株（12%）的表型確證試驗(yàn)為陽(yáng)性。因此，在本文中并未對(duì)相關(guān)的結(jié)果進(jìn)行修正，仍以原測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。針對(duì)表7中大腸埃希菌和克雷伯菌ESBL陰性菌株數(shù)，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院目前使用的藥敏卡片有AST-GN14 及AST-GN09 卡，由 于在日常工作中存在檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)不足等情況，導(dǎo)致有些侏儒型和不利用乳糖的大腸埃希菌及部分不典型克雷伯菌會(huì)使用AST-GN09 進(jìn)行藥敏檢測(cè)；ESBL 現(xiàn)在不作為常規(guī)耐藥監(jiān)測(cè)，對(duì)于未做ESBL檢測(cè)的大腸埃希菌及克雷伯菌株沒(méi)有進(jìn)行手工紙片擴(kuò)散法復(fù)核，導(dǎo)致ESBL陰性菌株數(shù)有一定的差異。

最近10 余年，CRE 菌株在全世界范圍出現(xiàn)并流行［9-11］。據(jù)英國(guó)抗生素耐藥監(jiān)測(cè)及參考實(shí)驗(yàn)室（ARMRL）的數(shù)據(jù)顯示，2010年產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌較2003年增長(zhǎng)了近300 倍［12］。中國(guó)CHINET 顯示2005年對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為2.9%和2.8%，2011年分別為9.3%和9.4%［13］。但兒童特別是新生兒患者鮮見(jiàn)報(bào)道［14］。我國(guó)臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌主要產(chǎn)KPC-2 型碳青霉烯酶［11］。董方等［15］研究表明，兒科患者對(duì)碳青霉烯類不敏感腸桿菌科細(xì)菌中，imp 基因陽(yáng)性占82.6%。

產(chǎn)ESBL菌株逐年升高，CRE 菌株不斷出現(xiàn)，應(yīng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，查明感染源和傳播途徑，采取有效的感染控制措施防止耐藥菌感染在病房中流行，避免引起全院范圍播散，已刻不容緩。

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