茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣遺傳毒性的防護(hù)作用

黃波，龍穎，李東陽

南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽南華大學(xué) 421001

吸煙與健康

茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣遺傳毒性的防護(hù)作用

黃波，龍穎，李東陽

南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽南華大學(xué) 421001

目的 研究卷煙煙氣所致人支氣管上皮細(xì)胞DNA損傷以及茶多酚二甲基亞砜合劑的保護(hù)作用，為卷煙煙氣對機(jī)體損傷的防護(hù)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將細(xì)胞分為5組：空白組、卷煙煙氣組、茶多酚保護(hù)組、二甲基亞砜保護(hù)組、茶多酚二甲基亞砜合劑保護(hù)組；通過檢測微核和多核細(xì)胞觀察染色體損傷，彗星實(shí)驗(yàn)及H2AX蛋白磷酸化檢測DNA的損傷，多核細(xì)胞法檢測細(xì)胞HPRT突變。結(jié)果 BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)卷煙煙氣染毒后，細(xì)胞的微核率、多核率、拖尾率升高，H2AX蛋白磷酸化表達(dá)增高，HPRT突變率增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），茶多酚保護(hù)組、二甲基亞砜保護(hù)組能降低卷煙煙氣誘發(fā)的DNA損傷，合劑保護(hù)組的防護(hù)作用最好。結(jié)論 卷煙煙氣對BEAS-2B細(xì)胞DNA具有損傷作用，茶多酚二甲基亞砜合劑有較強(qiáng)防護(hù)作用。

卷煙煙氣；茶多酚；二甲基亞砜；DNA損傷；防護(hù)作用

研究表明，肺癌的死亡率與煙草的消費(fèi)呈顯著正相關(guān)[1]。因此煙草被認(rèn)為是人類致癌物質(zhì)，自由基是卷煙煙氣中主要的一類有害物質(zhì)，能導(dǎo)致人體組織和細(xì)胞的氧化，損害細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞病變、癌癥等疾病[2-4]。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)卷煙煙氣抽提物（cigarette smoke condensates ，CSCs）染毒人支氣管細(xì)胞(human bronchial epithelial cells line，BEAS-2B)后，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基，隨CSCs染毒劑量而增高，細(xì)胞膜破裂，表現(xiàn)為細(xì)胞外的細(xì)胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶增高，細(xì)胞的DNA出現(xiàn)斷裂，微核細(xì)胞增多，基因突變率增高，表明卷煙煙氣通過誘發(fā)細(xì)胞自由基的大量產(chǎn)生，造成細(xì)胞的氧化損傷而引起遺傳毒性。在采用卷煙煙氣染毒時(shí)，加入茶多酚(tea polyphenols，TPs)，可使卷煙煙氣誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的自由基降低，細(xì)胞氧化損傷降低，能在一定程度減少從卷煙煙氣的危害。前期的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，二甲基亞砜(DMSO)對卷煙煙氣導(dǎo)致的人支氣管上皮細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷、自由基增多、基因位點(diǎn)突變有較好的防護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)DMSO對卷煙煙氣作用于BEAS-2B細(xì)胞后，可引起彗星實(shí)驗(yàn)中彗星細(xì)胞增多，DNA損傷加重，具有一定程度的抑制作用，表明二甲基亞砜、茶多酚均能一定程度上降低卷煙煙氣的氧化損傷[5-6]。

為更好地降低卷煙的危害，本實(shí)驗(yàn)通過采用茶多酚和二甲基亞砜的合劑，采用人支氣管上皮細(xì)胞系（BEAS-2B細(xì)胞）作為靶細(xì)胞，驗(yàn)證對卷煙煙氣抽提物所致遺傳毒性的防護(hù)作用，為控制卷煙煙氣危害及開發(fā)相關(guān)新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人支氣管上皮細(xì)胞（ BEAS-2B細(xì)胞）為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院朱茂祥教授惠贈，以無血清培養(yǎng)基LHC-8培養(yǎng)，DMSO購自美國SIGMA公司，茶多酚（無錫太陽綠寶科技有限公司），卷煙煙氣抽提物（CSCs）：將標(biāo)準(zhǔn)參照卷煙（2R4F，肯塔基大學(xué)，美國），通過JJD200型單通道吸煙機(jī)（鄭州煙草研究院）導(dǎo)入氣泡吸收管中的乙醇和細(xì)胞培養(yǎng)基（V/V= 1:1）收集抽提物，配制成1支煙/mL的卷煙煙氣抽提物儲備液，-80℃貯存?zhèn)溆肹5]。

1.2 細(xì)胞分組及處理

處于對數(shù)生長期的人支氣管上皮細(xì)胞分為5組：對照組(BEAS-2B)、卷煙煙氣組(CSCs)、茶多酚保護(hù)組（CSCs+TPs）、二甲基亞砜保護(hù)組（CSCs+DMSO）、茶多酚二甲基亞砜合劑保護(hù)組（CSCs+TPs+DMSO）。卷煙煙氣組細(xì)胞加入終濃度為0.01支/mL卷煙煙氣抽提物；茶多酚保護(hù)組加入終濃度為 250 mg/L茶多酚、二甲基亞砜保護(hù)組加入終濃度為0.5% 二甲基亞砜，茶多酚二甲基亞砜合劑保護(hù)組加入0.5%二甲基亞砜+250mg/L 茶多酚，3個(gè)保護(hù)組加入上述保護(hù)劑后在細(xì)胞培養(yǎng)中孵育2h后，再加入終濃度為 0.01支/mL卷煙煙氣抽提物，染毒24h。

1.3 微核多核細(xì)胞檢測

細(xì)胞染毒24h后，棄去培養(yǎng)液，用冰冷的PBS洗凈，消化細(xì)胞，離心，以固定液（甲醇:乙酸=3:1）重懸細(xì)胞固定 15 min，Giemsa染色后，在油鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)每1000個(gè)細(xì)胞中微核細(xì)胞數(shù)和多核細(xì)胞數(shù)。

1.4 中性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（彗星實(shí)驗(yàn)）

實(shí)驗(yàn)分組與染毒同上，染毒24h后，收集細(xì)胞制成懸液；收取細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)；將50-80μL 1%標(biāo)準(zhǔn)熔點(diǎn)瓊脂糖滴在預(yù)熱70-80℃毛玻璃載玻片上，以蓋玻片壓平膠液，放于4℃，冷卻至膠液凝結(jié)；將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞按照1:5的比例與低熔點(diǎn)的瓊脂糖混勻，大約加入5000個(gè)細(xì)胞以蓋玻片壓平膠液，放于4℃，冷卻至膠液凝結(jié)；以100μl低熔點(diǎn)的瓊脂糖制作上層膠，冷卻至膠液凝結(jié)；去除蓋玻片，將膠塊浸泡在4℃的中性細(xì)胞裂解液中，避光，90-120min，以Tris-硼酸（終濃度為0.5%，pH：8.2-8.5）浸泡膠塊清洗殘余的裂解液60min，重復(fù)3次；水平電泳槽中放入玻片，加入中性緩沖液蓋過膠塊3-5毫米左右，以25-30V于4℃冰箱中電泳30分鐘，保持電流為5mA，取出玻片放于無Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，每片載玻片上加1.5μg/mL 的碘化丙錠，避光染色10min，400倍光鏡下計(jì)數(shù)彗星細(xì)胞并拍照觀察并拍照（奧林巴斯熒光顯微鏡顯）；彗星細(xì)胞用casp.exe軟件分析尾部DNA%、尾長。

1.5 磷酸化 H2AX蛋白表達(dá)檢測（Western Blot）

5組細(xì)胞處理完畢后，收集細(xì)胞團(tuán)塊，加入蛋白裂解液，收集蛋白。用β-actin作為內(nèi)參，具體步驟如下：

將提取的5組細(xì)胞蛋白按100μg總蛋白量上樣，15%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳到標(biāo)記的溴酚蘭至玻璃板的底部2h后停止電泳；以半干轉(zhuǎn)膜儀80V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜膜3h，TBST洗膜5分鐘×3；以10%的TBST奶粉封閉液浸泡纖維膜，在生化培養(yǎng)箱中保溫孵育1h，或4℃過夜；室溫TBST洗膜5分鐘；根據(jù)NC膜上的蛋白分子量標(biāo)記將膜分為兩半，一半檢測β-actin蛋白，下一部分用于H2AX蛋白，將NC膜放入含β-actin抗體和H2AX抗體的緩沖液中（1:1000），生化培養(yǎng)箱中保溫孵育1h，或4℃過夜；室溫TBST洗膜3次，每次5分鐘；根據(jù)β-actin抗體和H2AX抗體的屬性，分別用對應(yīng)的二抗TBST緩沖液（1: 1,000），生化培養(yǎng)箱中保溫孵育1h，洗去二抗TBST緩沖液；避光顯色檢測兩種細(xì)胞中β-actin蛋白和H2AX蛋白表達(dá)。

1.6 HPRT基因突變檢測[7]

細(xì)胞分別處理后，棄去原有的培養(yǎng)液，換新鮮的培養(yǎng)液，傳代5次后，分為兩部分，一部分在培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1mmol/L 6-巰基鳥嘌呤，另一部分常規(guī)培養(yǎng)，兩部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)30 h后，均加入終濃度為6μg/mL的細(xì)胞松弛素B，37℃培養(yǎng)42 h；終止培養(yǎng)后，消化離心，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，固定液（醋酸:甲醇 =1:3）室溫15min；滴片干燥，吉姆薩染色15-20min，清洗，光學(xué)顯微鏡鏡（1000倍）觀察5000個(gè)細(xì)胞，記錄在同一胞漿內(nèi)具有完整核膜的雙核或多核細(xì)胞（包括相壓、相切和分離的雙核或多核細(xì)胞數(shù)）。以6-TG培養(yǎng)的每1000個(gè)細(xì)胞中的多核或雙核細(xì)胞數(shù)和常規(guī)培養(yǎng)的每1000個(gè)細(xì)胞中雙核或多核細(xì)胞數(shù)之比，為HPRT基因位點(diǎn)發(fā)生突變的頻率（‰）。

1.7 數(shù)據(jù)處理分析

用SPSS 13.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用χ－±s 表示。保護(hù)組與對照組、保護(hù)組與卷煙煙氣組間的比較采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卷煙煙氣致細(xì)胞微核多核發(fā)生的影響及茶多酚二甲基亞砜合劑的防護(hù)作用

0.01支/mL卷煙煙氣能導(dǎo)致人支氣管上皮細(xì)胞的多核細(xì)胞及微核細(xì)胞發(fā)生率增高（與對照組比較，P＜0.05），表明具有較明顯的遺傳毒性。3個(gè)保護(hù)組對誘發(fā)微核率及多核率增高有明顯的抑制作用（與煙氣組比較，P＜0.05），在3個(gè)保護(hù)組中，茶多酚二甲基亞砜合劑保護(hù)組的防護(hù)作用較二甲基亞砜、茶多酚單獨(dú)使用更為顯著（P＜0.05）。

表1 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致微核多核細(xì)胞數(shù)增多的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 1 Multinucleated cells and micronucleus induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

2.2 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致細(xì)胞拖尾數(shù)增多的抑制作用

在單細(xì)胞凝膠電泳中，可見卷煙煙氣染毒后可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞出現(xiàn)顯著的DNA損傷，表現(xiàn)為彗星細(xì)胞數(shù)、彗星尾部DNA百分比增加，彗星尾長變長，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3個(gè)保護(hù)組對卷煙煙氣誘發(fā)的細(xì)胞DNA的損傷具有有明顯的抑制作用，與卷煙煙氣組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在3個(gè)保護(hù)組中，茶多酚二甲基亞砜合劑保護(hù)組的防護(hù)作用較二甲基亞砜、茶多酚單獨(dú)使用更為顯著（P＜0.05）。

表2 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致DNA損傷的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 2 DNA damage induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

2.3 H2AX磷酸化檢測

由圖1可見，內(nèi)參β－actin蛋白表達(dá)量各組基本均一，表示各組細(xì)胞上樣量均一、準(zhǔn)確。H2AX（Ser139）蛋白表達(dá)條帶中，光密度值由高到低是卷煙煙氣組、茶多酚組、二甲基亞砜組、茶多酚二甲基亞砜合劑保護(hù)組光密H2AX（Ser139）磷酸化程度表明卷煙煙氣導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞顯著的DNA損傷；而3個(gè)保護(hù)組能具有抑制卷煙煙氣DNA損傷的能力，其中茶多酚二甲基亞砜合劑保護(hù)組的保護(hù)作用最強(qiáng)。

2.4 HPRT基因突變檢測

基因位點(diǎn)突變率檢測發(fā)現(xiàn)，卷煙煙氣可引起細(xì)胞HPRT基因突變率增高（P＜0.05）；3個(gè)保護(hù)組可抑制卷煙煙氣引起的突變率增高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致細(xì)胞Phospho-Histone H2AX表達(dá)增高的影響Fig. 1 Expression of Phospho-Histone H2AX induced by CSCs in BEAS-2B and the protective effect of TPs DMSO mixture

表3 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致細(xì)胞HPRT基因突變率增高的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 3 HPRT mutation frequency induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

3 討論

卷煙煙氣中有150多種化學(xué)成分有明確毒理學(xué)資料顯示具有毒性，并被稱為煙草煙氣有害成分[8,9]。這部分化學(xué)成分具有較強(qiáng)的刺激性、致癌性和促癌性，可造成人體多器官多系統(tǒng)損傷，我們的研究也證明了這一點(diǎn)[5,6]。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，觀察到卷煙煙氣可以導(dǎo)致自由基的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞的抗氧化酶系出現(xiàn)失衡，細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷，誘發(fā)遺傳毒性的產(chǎn)生，而茶多酚能夠在一定程度上抑制卷煙煙氣的危害[5]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，人支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)卷煙煙氣染毒后導(dǎo)致的細(xì)胞出現(xiàn)大量的微核多核細(xì)胞，彗星細(xì)胞增多，磷酸化H2AX蛋白高表達(dá)，HPRT突變率增高，表明卷煙煙氣具有較強(qiáng)的遺傳毒性，各保護(hù)組均能有效抑制卷煙煙氣的DNA損傷，其中茶多酚與二甲基亞砜配合后的防護(hù)效果好于兩者單獨(dú)使用。說明茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣引起的DNA和染色體損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

基因突變可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，所以檢測敏感基因位點(diǎn)的突變率，是一種有效預(yù)測癌癥發(fā)生的有效手段，HPRT基因就符合我們的需要，它的突變可受多種環(huán)境因素的影響，在多種人類腫瘤細(xì)胞中，可以發(fā)現(xiàn)HPRT突變頻率比功能正常的腫瘤細(xì)胞高50-750倍[10]。

在多種檢測DNA損傷的手段中，γ-H2AX的形成意味著DNA雙鏈的斷裂，是一個(gè)快速敏感的細(xì)胞反應(yīng)，而且γ-H2AX表達(dá)高低是和外源性因素的劑量、強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間成正相關(guān)的，當(dāng)DNA出現(xiàn)雙鏈斷裂時(shí)，可以通過γ-H2AX的表達(dá)量來檢測DNA受損的嚴(yán)重程度[11,12]，是一個(gè)有效檢測DNA損傷的生物標(biāo)志物。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，茶多酚與二甲基亞砜配合后的防護(hù)效果好于兩者單獨(dú)使用。由于生物機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生是一個(gè)多步驟，網(wǎng)絡(luò)式的產(chǎn)生過程。單獨(dú)使用一種自由基清除劑，僅能對其中一個(gè)步驟或節(jié)點(diǎn)產(chǎn)生作用，效率不高。如果能用多種性質(zhì)不同、針對不同自由基產(chǎn)生節(jié)點(diǎn)的自由基清除劑組成復(fù)合自由基清除劑將會產(chǎn)生更好的效果，達(dá)到高效防護(hù)自由基的損傷作用。近年來，國內(nèi)外專家分別提出了“抗氧化復(fù)合鏈”和“抗氧化網(wǎng)絡(luò)”等概念，已逐漸成為抗氧化劑研究的一個(gè)熱點(diǎn)[13]。多種性質(zhì)自由基清除劑構(gòu)成的抗氧化劑網(wǎng)絡(luò)，由于彼此之間的協(xié)同作用，而使其自由基清除能力被放大，還可顯著提高彼此的活性。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)雖然茶多酚及二甲基亞砜單獨(dú)使用對自由基的去除有一定的效果，但未達(dá)到理想的結(jié)果。所以，我們以上述理論為指導(dǎo)，采用性質(zhì)不同的自由基防護(hù)劑茶多酚、二甲基亞砜聯(lián)合作用，研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)達(dá)到了很好的防護(hù)效果，比單一使用效果更佳。這為卷煙的減害研究提供了新的思路。

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Protective effects of TPs DMSO mixture against genotoxicity of cigarette smoke

HUANG Bo, LONG Ying, LI Dongyang
School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, Hunan, China

Cigarette smoke condensates（CSC）induced DNA damage in BEAS-2B cells and protective effect of tea polyphenols DMSO mixture were studied with an objective to offer theoretical and experimental basis for protection against CSC-induced damage. BEAS-2B cells were divided into 5 groups, i.e. control, CSC, tea polyphenol protection, DMSO protection and TPs DMSO mixture protection.Chromosomal damage was determined by measuring the frequency of micronuclei and multinucleated cells. DNA damage was examined by comet assay and level of γH2AX. Gene mutation was detected by HPRT gene mutation assay. Results showed that after BEAS-2 B cells were exposed to CSC, frequency of micronuclei and multinucleated cells, tail length, expression of H2AX protein phosphorylation and mutation rate of HPRT were all increased signi fi cantly (P ＜ 0.05). Three protection groups effectively reduced these changes and tea polyphenol DMSO mixture protection group was proved the best group. It was concluded that CSC can cause DNA damage of BEAS-2 B cells and tea polyphenols DMSO mixture has a strong protective effect.

CSC; BEAS-2 B cells; tea polyphenols DMSO mixture; DNA damage; protective effect

:HUANG Bo, LONG Ying, LI Dongyang. Protective effects of TPs DMSO mixture against genotoxicity of cigarette smoke [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(2)

黃波，龍穎，李東陽.茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣遺傳毒性的防護(hù)作用[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2015,21（2）

國家自然科學(xué)基金資助(No. 81272994)

黃波（1974—），副教授，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境化學(xué)致癌及其醫(yī)學(xué)防護(hù)，Email: huangbo0930@163.com

2014-04-16