康懷彬，肖天天，李凈凈，楊 橋，楊華田，尤曉顏,*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

嗜冷普魯蘭酶產(chǎn)生菌NX-1的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

康懷彬1，肖天天1，李凈凈1，楊 橋2，楊華田1，尤曉顏1,*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

從南極海泥樣品中分離得到一株產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的假交替單胞菌菌株（Pseudoalteromonas sp.）NX-1。以菌株NX-1為研究對象，對菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的酶學性質(zhì)進行了初步研究，并通過單因素試驗和正交試驗對其產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最佳培養(yǎng)條件進行研究。結(jié)果顯示，菌株NX-1所產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最適作用溫度為20 ℃，最適作用pH值為7.0，在最適條件下，酶的半衰期約為120 min；菌株NX-1的最適產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)溫度20 ℃、接種量1%、培養(yǎng)基各組分含量分別為蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L。優(yōu)化后菌株產(chǎn)酶可達25.172 U/mL，相比優(yōu)化前提高25.1%。

嗜冷普魯蘭酶；假交替單胞菌；發(fā)酵；正交試驗

淀粉作為一種重要原料被廣泛應用于食品加工、生物能源等工業(yè)領域[1]。工業(yè)用淀粉質(zhì)原料中通常含有75%～85%的支鏈淀粉，支鏈淀粉中α-1,6-糖苷鍵的水解程度將直接影響到淀粉質(zhì)原料的利用效率[2]。為此，在淀粉制糖工業(yè)中，通常通過添加一定量的普魯蘭酶來提高支鏈淀粉的利用效率。該酶可以特異性地水解普魯蘭糖、支鏈淀粉等分枝多糖分子內(nèi)的α-1,6-糖苷鍵，生成相應的麥芽三糖和直鏈多糖[3]。研究表明，在淀粉糖化過程中，添加一定量的普魯蘭酶，不僅可以降低糖化酶的用量，還可以顯著提高淀粉的糖化效率、縮短反應時間，因此在淀粉深加工和生物能源等工業(yè)部門具有廣泛的應用前景[4-5]。

普魯蘭酶最早從肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中分離得到[6]，其獨特的性狀及其在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應用潛能，使得不同類型的普魯蘭酶相繼從不同類型的微生物中分離得到[1,3-4]。一些普魯蘭酶的基因也不斷被克隆、鑒定，以及異源表達[4,7-9]，少數(shù)普魯蘭酶的晶體結(jié)構(gòu)也得到了解析[10-12]，為開展普魯蘭酶的工業(yè)化應用提供了理論指導。在淀粉加工工業(yè)中，由于淀粉液化和糖化的溫度不同，液化轉(zhuǎn)入糖化時還需要降溫等工序，因此研究人員希望篩選得到耐熱性好的普魯蘭酶，將糖化和液化過程統(tǒng)一起來，從而簡化工藝、降低成本[13]。目前關于普魯蘭酶的研究主要集中于嗜熱、超嗜熱普魯蘭酶[14-16]，而對于嗜冷普魯蘭酶的研究國內(nèi)目前還尚未開展，國外近期才有相關研究報道[17-18]。嗜冷普魯蘭酶能夠在低溫條件下水解支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵，如果與低溫淀粉酶配合使用可以有效減少淀粉糖化過程中的能源消耗，在淀粉加工工業(yè)自身節(jié)能降耗要求的背景下，開展嗜冷普魯蘭酶的應用研究具有重要的研究價值。本研究從南極低溫環(huán)境樣品中，以普魯蘭糖為唯一碳源篩選得到一株產(chǎn)低溫普魯蘭酶菌株（Pseudoalteromonas sp.）NX-1，實驗不僅對菌株所產(chǎn)低溫普魯蘭酶的酶學性質(zhì)行了測定，并且通過正交試驗優(yōu)化了菌株的最適產(chǎn)酶條件，為開展低溫普魯蘭酶的工業(yè)化應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

南極海泥樣品來自雪龍?zhí)柕?9次科考取樣，由中國水產(chǎn)科學院東海水產(chǎn)研究所提供。樣品編號為P5-10和P5-4，取樣點位置坐標分別為59°30″S/043°00″W和60°00″S/042°00″W。

普魯蘭糖（生物純（C37H62O30）n） 生工生物工程（上海）股份有限公司；API 50CH試劑盒 法國梅里埃公司；其他試劑均為分析純。

鑒別培養(yǎng)基：普魯蘭糖3 g/L、蛋白胨10 g/L、人工海水1 000 mL、瓊脂2.0%，pH值自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L、人工海水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

GeneAmp?9700 PCR儀 美國生命技術公司；UV-1800型紫外分光光度計 日本島津公司；D-37520型高速離心機 美國Sigma公司；HYL-C型組合式溫控搖床太倉市強樂實驗設備有限公司；SW-CJ-2D潔凈工作臺蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

稱取1 g南極海底沉積物泥樣，加入到10 mL滅菌人工海水中，超聲分散（200 W，超聲1 s，停4 s，共15 個循環(huán)）后取1 mL培養(yǎng)液做梯度稀釋，涂布于篩選培養(yǎng)基的平皿中，置于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取平皿中長出的菌株，采用影印接種法將菌株轉(zhuǎn)接入篩選培養(yǎng)基平皿中，在平皿中分別噴灑魯格氏碘液和無水乙醇并觀察水解圈情況，挑取有水解圈的菌株接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，20 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液中普魯蘭酶活力。

1.3.2 菌株的鑒定及進化分析

采用酚-氯仿法人工提取基因組DNA[19]，采用通用引物27F和1492R擴增能菌株16S rRNA基因序列，引物序列為：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：AAGGAGGTGATCCAAGCC。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性60 s，58 ℃退火，40 s；72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物切膠純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序后的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定種屬類別，并使用Mega 5軟件采用鄰接法聚類構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。采用API 50CH試劑盒（法國梅里埃）鑒定菌株對不同碳源的利用情況，按照說明書進行操作。

1.3.3 嗜冷普魯蘭酶活力的測定

采用粗酶液測定嗜冷普魯蘭酶活力，收集發(fā)酵液，8 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定酶活力[20]。酶活力單位定義：在pH 7.0、溫度20 ℃條件下，每分鐘從普魯蘭糖底物釋放相當于1 μmol葡萄糖還原量所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 嗜冷普魯蘭酶的酶學性質(zhì)分析

在溫度為10、15、20、28、37、42 ℃條件下分別測定嗜冷普魯蘭酶的酶活力和菌懸液光密度（OD600nm）值，確定其最適反應溫度；在最適溫度下，測定不同pH 值（4～9）條件下嗜冷普魯蘭酶的酶活力，確定其最適反應pH值，pH 4～6.5采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L），pH 7～9采用Tris-HCl緩沖液（1 mol/L）；在最適pH值條件下，將酶液分別置于10、20、28、37、42 ℃條件下維持0、20、40、60、80、100、120 min，測定嗜冷普魯蘭酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。

1.3.5 單因素試驗設計及方法

選取不同碳源、氮源、金屬離子及磷酸根離子加入含有100 mL無菌人工海水溶液的250 mL錐形瓶中，以1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，在20 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。固定其他條件不變，分別考察碳源（蔗糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、乳糖、糊精等）及碳源質(zhì)量濃度（蔗糖5～40 g/L）、氮源（蛋白胨、玉米漿、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨等）及氮源質(zhì)量濃度（蛋白胨5～40 g/L）、金屬離子（氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、氯化鐵等）及金屬離子質(zhì)量濃度（鈣離子0～0.8 g/L）、磷酸根離子質(zhì)量濃度（0～16 g/L）對菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的影響。

1.3.6 正交試驗設計及方法

根據(jù)L9（34）正交表選取不同質(zhì)量濃度的蔗糖、蛋白胨、鈣離子及磷酸根離子組合配制發(fā)酵培養(yǎng)基。向含有100 mL人工海水溶液的250 mL錐形瓶中分別加入各組成分，以1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，在20 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，分別考察各組發(fā)酵培養(yǎng)基組分對低溫普魯蘭酶發(fā)酵效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定及生理生化性質(zhì)

圖1 菌株NX-1的分離鑒定結(jié)果Fig.1 Isolation and identifi cation of strain NX-1

初篩共分離得到10 株產(chǎn)普魯蘭酶菌株（圖1），通過搖瓶發(fā)酵實驗對初篩得到的菌株的產(chǎn)酶活力進行測定，其中6 株菌株能夠檢測到普魯蘭酶的活性，表明這些菌株能夠合成外泌型普魯蘭酶分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。這6 株菌株中，菌株NX-1的產(chǎn)酶活力最高（20.12 U/mg），通過16S rRNA測序比對后，發(fā)現(xiàn)菌株NX-1與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）物種相近，16S rRNA進化關系表明菌株NX-1與游海假交替單胞菌株（Pseudoalteromonas haloplanktis）最為接近，并與紫菜假交替單胞菌株（Pseudoalteromonas porphyrae）聚為獨立分枝（圖1c），表明菌株NX-1是屬于假交替單胞菌屬的一個物種，將菌株NX-1命名為Pseudoalteromonas sp. NX-1。菌株NX-1的最適生長溫度為20 ℃（圖2c），形態(tài)為短桿狀，革蘭氏染色結(jié)果為陰性菌，菌落呈乳白色凸起、光滑濕潤、不透明、邊緣整齊。采用梅里埃金標準微生物生理生化檢測試劑盒（API 50CH）對菌株NX-1的碳源利用情況進行了定性測定，結(jié)果表明菌株NX-1可以利用阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、松二糖等多種碳源進行生長，但不能利用葡萄糖、果糖、甘露糖生長。

2.2 嗜冷普魯蘭酶的酶學性質(zhì)

圖2 菌株NX-1所產(chǎn)普魯蘭酶酶學性質(zhì)分析Fig.2 Enzymatic properties of pullulanase from the psychrophilic strain

由圖2可知，在實驗條件下（pH 4～9，溫度10～42 ℃）均可以檢測到普魯蘭酶的酶活力，該酶的最適pH值為7.0，與之前報道的一些普魯蘭酶相近，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株TU、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）菌株FDTA-13、芽孢桿菌（Bacillus fl avocaldarius）菌株KP122以及Rhodothermus marines[3]。菌株NX-1所產(chǎn)普魯蘭酶的最適催化溫度為20 ℃，按照文獻對于低溫酶的分類[21]，其屬于嗜冷酶的范疇，因此確定該酶為嗜冷普魯蘭酶。對該嗜冷普魯蘭酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性進行測定（圖2d），結(jié)果表明，隨著時間的延長，酶在不同溫度下的穩(wěn)定性均呈下降趨勢，在120 min后，相對酶活力降低超過36.1%；在不同處理溫度下，隨著溫度的升高，酶的穩(wěn)定性呈快速下降趨勢，42 ℃保持120 min后，相對酶活力降低超過61.3%。在最適作用溫度條件下（20 ℃），酶的半衰期約為120 min（圖2d）。

2.3 培養(yǎng)基組分對菌株NX-1產(chǎn)酶的影響

2.3.1 不同種類碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

圖3 不同碳源對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on the yield of pullulanase

由圖3a可知，菌株NX-1不能利用單糖葡萄糖、二碳糖乳糖和三碳糖甘油為碳源生長產(chǎn)普魯蘭酶，但可以利用二碳糖蔗糖，并且在所有碳源中蔗糖對菌株NX-1產(chǎn)酶影響最大，在以蔗糖為唯一碳源的條件下，普魯蘭酶活力可達31.29 U/mL。對于所選取的4 種不同類型的淀粉，結(jié)果顯示玉米淀粉、紅薯淀粉和馬鈴薯淀粉對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響接近，而可溶性淀粉效果要低于上述3 種淀粉。在這4 種淀粉質(zhì)碳源中，玉米淀粉要略優(yōu)于其他3 種淀粉，在實驗條件下產(chǎn)生的普魯蘭酶活力可達24.29 U/mL。因此，蔗糖是最適合菌株NX-1產(chǎn)酶的碳源。實驗還考察了不同蔗糖用量對菌株NX-1產(chǎn)酶的影響（圖3b），結(jié)果表明當蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L時，普魯蘭酶活力最高，為31.41 U/mL。

2.3.2 不同氮源對菌株NX-1產(chǎn)酶的影響

以蔗糖（20 g/L）為碳源，通過在培養(yǎng)基中分別添加不同種類的氮源（10 g/L），測定發(fā)酵液中普魯蘭酶的活力，考察不同氮源對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響。結(jié)果表明（圖4a），菌株NX-1可以利用有機氮源和無機氮源生長產(chǎn)普魯蘭酶，但有機氮源要優(yōu)于無機氮源硫酸銨。在6 種有機氮源中，蛋白胨對菌株產(chǎn)酶的影響最大，玉米漿次之，大豆蛋白胨和牛肉膏作用相近，酵母膏對產(chǎn)酶影響最小。實驗條件下，以蛋白胨為唯一氮源，發(fā)酵液普魯蘭酶酶活力可達25.26 U/mL，是菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的最適氮源。考察不同蛋白胨用量對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響（圖4b），發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為10 g/L時，對促進菌株產(chǎn)普魯蘭酶作用最好。

圖4 不同氮源對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the yield of pullulanase

2.3.3 不同金屬離子對菌株NX-1產(chǎn)酶的影響

圖5 不同金屬離子對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.5 Effect of different metal ions on the yield of pullulanase

以蔗糖（20 g/L）為碳源、蛋白胨（10 g/L）為氮源，通過在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.4 g/L的不同種類的金屬鹽（CaCl2、MgCl2、FeCl3、NaCl、KCl、MnCl2），以不加金屬鹽離子作為對照，考察不同金屬離子對產(chǎn)普魯蘭酶的影響。結(jié)果表明（圖5a），與對照相比，Na+、K+、Ca2+、Mn2+對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶均有一定的促進作用，其中鈣離子對菌株NX-1的產(chǎn)酶促進作用最高，酶活力增加27%；Mn2+促進作用最低，僅為0.26%。相比較以上金屬離子，Mg2+和Fe3+在該質(zhì)量濃度下對菌株產(chǎn)酶具有抑制作用，其中Fe3+完全抑制菌株產(chǎn)酶。根據(jù)以上結(jié)果確定Ca2+是最適合菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的金屬離子?？疾觳煌珻a2+質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶的影響（圖5b），發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中CaCl2質(zhì)量濃度為0.4 g/L時，對促進菌株產(chǎn)普魯蘭酶作用最好。

2.3.4 磷酸鹽質(zhì)量濃度對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響

劉逸寒等[2]研究表明，磷酸鹽對枯草芽孢桿菌工程菌株產(chǎn)普魯蘭酶具有促進作用，基于此，本實驗以蔗糖（20 g/L）為碳源、蛋白胨（10 g/L）為氮源，在培養(yǎng)基中添加0.4 g/L的氯化鈣，考察不同質(zhì)量濃度Na2HPO4對菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的影響。由圖6可知，磷酸根對菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶具有一定的影響，當磷酸鹽質(zhì)量濃度為4 g/L時，對菌株NX-1產(chǎn)酶促進效應最強，發(fā)酵液中普魯蘭酶活力達到最高（32.322 U/mL），此后隨著磷酸鹽質(zhì)量濃度的升高，發(fā)酵液中普魯蘭酶活力逐漸降低。

圖6 磷酸鹽質(zhì)量濃度對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.6 Effect of phosphate concentration on the yield of pullulanase

2.4 菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶最佳培養(yǎng)基組分優(yōu)化

由單因素試驗可知，培養(yǎng)基中蔗糖、蛋白胨、CaCl2和磷酸鹽的用量對菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶有促進作用。為進一步考察各因素之間的相互作用及最佳組合，采用L9（34）的設計方案進行正交試驗。正交試驗結(jié)果表明（表1），接種量1%、培養(yǎng)溫度20 ℃的條件下，蔗糖和蛋白胨為菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的主要影響因素，4 個因素的影響程度依次為：蔗糖質(zhì)量濃度＞蛋白胨質(zhì)量濃度＞Na2HPO4質(zhì)量濃度＞CaCl2質(zhì)量濃度。各因素的最優(yōu)組合為：蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L，此時普魯蘭酶活力可達25.172 U/mL，較優(yōu)化前提高25.1%。

表1 培養(yǎng)基各組分正交試驗結(jié)果及極差分析Table 1 Results and variance analysis of orthogonal array experiments for optimization of medium components

3 結(jié) 論

嗜冷酶在低溫下可以保持較高的催化效率，能夠減少生產(chǎn)過程中的能耗、降低生產(chǎn)成本；此外在低溫條件下食品經(jīng)嗜冷酶處理有助于保持其品質(zhì)和風味，并降低中溫菌污染的風險；在處理結(jié)束后嗜冷酶經(jīng)過溫和的熱處理即可失活，不需要復雜的后續(xù)處理手段。嗜冷酶的這些特性使其在乳品、果汁、肉類加工等食品工業(yè)中得到了廣泛的應用。近年來，嗜冷酶資源的開發(fā)和應用成為食品工業(yè)的一個重要研究方向[21-23]。本研究從南極海泥樣品中分離得到一株產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶假交替單胞菌菌株NX-1，并對菌株所產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的酶學性質(zhì)進行了初步研究，同時利用L9（34）正交試驗對菌株產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，菌株NX-1所產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最適作用溫度為20 ℃，最適作用pH值為7.0，在最適條件下，酶的半衰期約為120 min；影響菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的主要因素依次為蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4和CaCl2，菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最佳培養(yǎng)條件為蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L，在此條件下所得普魯蘭酶活力可達25.172 U/mL，較優(yōu)化之前提高25.1%。通過對嗜冷普魯蘭酶的研究可為進一步研究其嗜冷機制、提高熱穩(wěn)定性、以及開展低溫普魯蘭酶的工業(yè)化應用提供研究材料和理論指導。

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Screening of Psychrophilic Strain NX-1, a Pullulanase-Producing Bacterium and Optimization of Culture Conditions for Pullulanase Production

KANG Huaibin1, XIAO Tiantian1, LI Jingjing1, YANG Qiao2, YANG Huatian1, YOU Xiaoyan1,*
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China)

In the present study, a psychrophilic pullulanase-producing strain, Pseudoalteromonas sp. NX-1, was isolated from Antarctic marine sediment samples with optimum growth temperature of 20 ℃. The enzymatic properties of pullulanase from strain NX-1 were investigated. The medium composition and culture conditions for pullulanase production by NX-1 were optimized by single factor and orthogonal array experiments. The results showed the optimum catalytic pH of the pullulanase was 7.0, and the half-life was 120 min at optimal catalytic conditions. The pullulanase activity of this isolate was infl uenced in decreasing order by the following medium components sugar, peptone, CaCl2and Na2HPO4. The optimal culture conditions were 20 ℃ and an inoculum size of 1% using a medium consisting of 15 g/L sugar, 15 g/L peptone, 0.5 g/L CaCl2and 6 g/L Na2HPO4. The yield of pullulanase was improved by 25.1% when compared to that obtained before optimization that before.

psychrophilic pullulanase; Pseudoalteromonas; fermentation; orthogonal experiments

Q815

A

1002-6630（2015）01-0118-06

10.7506/spkx1002-6630-201501023

2014-08-17

國家自然科學基金青年科學基金項目（31200035）；河南科技大學博士啟動基金項目（090061608）；河南科技大學研究生創(chuàng)新基金項目（CXJJ-YJS-Z008）；河南科技大學大學生訓練計劃項目（2013122）

康懷彬（1963—），男，教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及質(zhì)量控制。E-mail：khbin001@163.com

*通信作者：尤曉顏（1979—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：xiaoyanyou@hasust.edu.cn