李　鑫，胡世弟(綜述)，戴如春(審校)

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院代謝內(nèi)分泌研究所，長(zhǎng)沙 410011； 2.湘潭市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 湘潭 411100)

外周血間充質(zhì)干細(xì)胞在骨代謝中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李鑫1,2△，胡世弟1△(綜述)，戴如春1※(審校)

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院代謝內(nèi)分泌研究所，長(zhǎng)沙 410011； 2.湘潭市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 湘潭 411100)

正常成熟骨的代謝主要以骨重建形式進(jìn)行，在調(diào)節(jié)激素和局部細(xì)胞因子等的協(xié)調(diào)作用下，骨組織舊骨被吸收，新骨生成，此過(guò)程主要由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞完成，兩者是骨代謝過(guò)程中的重要核心細(xì)胞。成骨細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞分化產(chǎn)生。間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于中胚層具有多向分化潛能的干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，可以在體外擴(kuò)增。一定條件下，可以誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱、肌肉、脂肪等組織細(xì)胞[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞大部分定居于骨髓，但也可出現(xiàn)于外周血中[2]。外周血是一個(gè)很容易獲取成體干細(xì)胞作為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的資源。抽取骨代謝疾病患者外周血標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，對(duì)人體創(chuàng)傷小，通過(guò)檢測(cè)其中間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征，有利于疾病的早期診斷、治療及預(yù)防?，F(xiàn)就其在骨代謝中的應(yīng)用研究進(jìn)展予以綜述。

1外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的存在

1.1外周血間充質(zhì)干細(xì)胞存在的依據(jù)現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)證明，有成骨分化潛能的干細(xì)胞不僅存在于骨髓，也可出現(xiàn)于外周血中。Zvaifler等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)外周血單個(gè)核細(xì)胞中，存在一部分細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，有可塑性，附壁生長(zhǎng)，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，能分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同組織。Kuznetsov等[3]將外周血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增后移植至免疫功能不全的小鼠皮下組織中，通過(guò)特殊的探針技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該部位分化出大量的骨細(xì)胞，證實(shí)哺乳動(dòng)物的外周血中確實(shí)存在有成骨分化潛能的干細(xì)胞。Otsuru等[4]將綠色熒光蛋白標(biāo)記的骨祖細(xì)胞植入自身骨髓系統(tǒng)已遭放射線破壞的大鼠體內(nèi)后，在最新的骨生成部位發(fā)現(xiàn)有帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的成骨細(xì)胞，從而證實(shí)骨祖細(xì)胞是經(jīng)外周血液循環(huán)達(dá)到其他部位。近期，Zhang和Huang[5]總結(jié)提出外周血單個(gè)核細(xì)胞中包含大量能分化成不同種類(lèi)的祖細(xì)胞，在合適條件下，能分化成血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。

1.2外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的量或濃度Kuznetsov等[3]分別從小鼠、兔子、豚鼠、人類(lèi)的外周血中獲得有成骨分化潛能的貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，這些細(xì)胞的量十分稀少，小鼠和豚鼠中包含1×10-6,兔子中為1×10-7，人類(lèi)為1×10-8,甚至更少。Zvaifler 等[2]使用細(xì)胞洗滌法在人類(lèi)外周血中分離出小的、圓形的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后形成成纖維樣細(xì)胞，該類(lèi)細(xì)胞有分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的潛能，在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的濃度為0.3%～0.7%。Eghbali-Fatourechi等[6]用骨鈣素抗體標(biāo)記外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中表達(dá)骨鈣素陽(yáng)性細(xì)胞的比例為0.5%～0.8%，這與Zvaifler等[2]的研究數(shù)據(jù)是一致的。

1.3外周血間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離外周血間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離常見(jiàn)的方法有以下兩種。①密度梯度離心結(jié)合貼壁生長(zhǎng)法：根據(jù)血液中細(xì)胞成分的比重不同，采用淋巴細(xì)胞分離液將肝素化的外周血單個(gè)核細(xì)胞分離出來(lái)，再在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過(guò)更換培養(yǎng)液方式除去懸浮細(xì)胞，可獲得純度達(dá)95%的間充質(zhì)干細(xì)胞，此方法目前常應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究中。②利用間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分離細(xì)胞：主要有流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠分選法。前者利用相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體進(jìn)行篩選，后者是通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞表面帶有的抗原成分或缺失的抗原成分進(jìn)行正選或負(fù)選，從而分離細(xì)胞。由于間充質(zhì)干細(xì)胞特殊的生物學(xué)特性以及其含量很低，而且抗原表面不特異，當(dāng)前用此方法分離純化可行性不高[7]。

1.4外周血間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的分化可能是隨機(jī)非方向性的。已經(jīng)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞依舊具有轉(zhuǎn)化生成其他類(lèi)型間充質(zhì)細(xì)胞的潛能。個(gè)體不同發(fā)育階段的間充質(zhì)干細(xì)胞的表型存在差異[8]。迄今為止對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定沒(méi)有特異的分子標(biāo)記，這方面有待進(jìn)一步深入研究。目前普遍認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29、CD73、CD90、CD105、CD44和 CD166[9-11]。主要結(jié)合其形態(tài)特征、表面標(biāo)記及其具有向骨、脂肪、軟骨等多種方向的分化潛能而進(jìn)行鑒定[12]。

2外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的性質(zhì)及功能

人類(lèi)外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度在一定年齡段內(nèi)，隨著年齡增加而增長(zhǎng)。Eghbali-Fatourechi等[6,13]通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢查、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)手段檢測(cè)證實(shí)了該觀點(diǎn)，其在2005年通過(guò)對(duì)比青春發(fā)育期男性及正常成年男性?xún)山M人群，就已提到青春發(fā)育期男性在生長(zhǎng)高峰期，外周血中表達(dá)骨鈣素陽(yáng)性細(xì)胞的濃度是持續(xù)增加的。Dalle等[14]發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者外周血間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量也是增加的，只是它們經(jīng)歷了異常的骨分化。最近，F(xiàn)u等[15]通過(guò)染色體組型分析、抵抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)比較外周血間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們的生物學(xué)特征是一致的。Undale 等[16]通過(guò)比較絕經(jīng)后女性外周血中和骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞也得出了該結(jié)論。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞是怎樣到達(dá)外周血液參與骨重建的？早在2001年Hauge等[17]建立的血管骨重建單元學(xué)說(shuō)有助于解釋此疑問(wèn)。該學(xué)說(shuō)提到，骨重建單元中含有毛細(xì)血管，有分化為成骨潛能的細(xì)胞(包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓非附壁成骨前體細(xì)胞、血管壁中表達(dá)CD34陽(yáng)性的祖細(xì)胞分化成的外膜細(xì)胞、普通的內(nèi)皮祖細(xì)胞)不是直接在骨髓腔中分化成形到達(dá)皮質(zhì)骨，而是進(jìn)入毛細(xì)血管輸入端，部分在血管中分化形成成骨細(xì)胞黏附于皮質(zhì)骨參入骨重建，部分從毛細(xì)血管輸出端離開(kāi)。在骨質(zhì)疏松患者中[14]，由于骨轉(zhuǎn)換增加，動(dòng)員至外周血的成骨祖細(xì)胞也是增加的，但是這些細(xì)胞由于基因表達(dá)異常，不能分化為正常有功能的成熟骨細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的數(shù)量減少，但分化為脂肪細(xì)胞的數(shù)量增加，提示脂肪細(xì)胞分化增加可能是以減少成骨分化為代價(jià)的。所以，外周血間充質(zhì)干細(xì)胞異常分化導(dǎo)致骨重建異常是引起骨量丟失的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制。

3外周血間充質(zhì)干細(xì)胞可能存在的臨床應(yīng)用

3.1輔助早期診斷骨代謝疾病Dalle等[14]選取正常和骨質(zhì)疏松兩類(lèi)人群作為研究對(duì)象，從外周血中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，將形成的成纖維細(xì)胞集落形成單位作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)分別完善兩組人群的腰椎骨密度，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者成纖維細(xì)胞集落形成單位較正常人多，提示骨質(zhì)疏松患者外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的量與骨密度呈反比。因此，檢測(cè)外周血間充質(zhì)干細(xì)胞量可能作為一種非侵襲性方法輔助早期診斷骨代謝病。

3.2治療骨代謝疾病從外周血中獲取間充質(zhì)干細(xì)胞簡(jiǎn)便易行、創(chuàng)傷小、易于分離培養(yǎng)，增殖能力強(qiáng)，可體外克隆擴(kuò)增，回輸入體內(nèi)治療骨代謝疾病。Tadokoro等[18]采用同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注治療低磷酸酶癥患者取得了成功。骨髓來(lái)源于患兒的父親，取出新鮮骨髓體外培養(yǎng)，并用不同的培養(yǎng)方法促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，再將其靜脈輸注入患兒體內(nèi)，獲得了較好的療效。Toupadakis等[19]在兩組小鼠股骨骨折模型中，一組經(jīng)皮下注射一種趨化因子4受體抗體——AMD3100，動(dòng)員骨髓干細(xì)胞移至外周血液，另一組注射生理鹽水作為對(duì)照。3個(gè)月后，分別檢測(cè)兩組小鼠中外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的含量，同時(shí)使用計(jì)算機(jī)斷層掃描骨折部位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射AMD3100的小鼠外周血液中間充質(zhì)干細(xì)胞含量較多，且骨折部位骨密度明顯增加。最近一項(xiàng)5年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，在股骨頭壞死患者的早期階段，經(jīng)股動(dòng)脈注入自體間充質(zhì)干細(xì)胞，有助于緩解疼痛，提高髖關(guān)節(jié)功能，延遲股骨頭壞死的進(jìn)展[20]。

3.3結(jié)合傳統(tǒng)骨代謝指標(biāo)監(jiān)測(cè)藥物療效Suriyachand等[21]選取43例年齡為25～90歲的人群，分為<60歲、60～79歲、≥80歲三個(gè)不同年齡組，分別用骨鈣素抗體標(biāo)記外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分析，同時(shí)選?、裥湍z原交聯(lián)C端肽、Ⅰ型前膠原N端肽及骨鈣素三個(gè)骨代謝評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡≥80歲組外周血成骨祖細(xì)胞百分比與成骨代謝指標(biāo)呈正比。Rubin等[22]在甲狀旁腺功能減退的患者中，通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的劑量，促進(jìn)外周血成骨祖細(xì)胞增加，發(fā)現(xiàn)成骨祖細(xì)胞數(shù)量增加與髖骨中成骨功能指標(biāo)變化一致。基于此相關(guān)性，可利用外周血間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)預(yù)測(cè)成骨細(xì)胞的活性，用于臨床骨代謝疾病藥物跟蹤治療的療效評(píng)價(jià)。

3.4通過(guò)判斷成骨分化潛能預(yù)防骨代謝疾病Valenti等[23]通過(guò)分析外周血間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程中的基因表達(dá)，證實(shí)該類(lèi)細(xì)胞能分化為成骨細(xì)胞。鑒于此特點(diǎn)，未來(lái)可以檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中某特征基因的表達(dá)而了解成骨分化潛能。根據(jù)Smiler等[24]研究，可通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面分別代表破骨和成骨分化的分子標(biāo)記，比骨代謝生化指標(biāo)更早地了解骨轉(zhuǎn)換傾向，早期判斷骨質(zhì)量改變程度，盡早選擇藥物干預(yù)，預(yù)防骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病。

4小結(jié)

應(yīng)用外周血間充質(zhì)干細(xì)胞，不僅可能建立臨床可用的骨代謝疾病的最新檢測(cè)手段和方法，而且能早期診斷、治療、預(yù)防代謝性骨病。但在判斷骨分化過(guò)程中，由于代表破骨和成骨分化潛能的分子標(biāo)志物特異性不高，可能需要多分子標(biāo)志聯(lián)合檢測(cè)，提高其精確性，有待進(jìn)一步深入研究。此外，外周血間充質(zhì)干細(xì)胞在正常的骨重建、骨折愈合等過(guò)程中所扮演的精確角色仍不能完全肯定，需要進(jìn)一步探索。同時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞的許多生物學(xué)特征和多分化潛能的分子機(jī)制尚不完全明確，還需不斷探究，進(jìn)一步掌握它們的分化能力、可移植性和生物安全性。

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摘要：外周血間充質(zhì)干細(xì)胞是從外周血液中分離得到的一種成體干細(xì)胞，性質(zhì)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)一致，異常分化引起骨代謝平衡改變導(dǎo)致骨量丟失。外周血間充質(zhì)干細(xì)胞能即時(shí)動(dòng)態(tài)地反映正在進(jìn)行的骨重建狀況，對(duì)代謝性骨病的早期診斷、預(yù)測(cè)骨丟失和監(jiān)測(cè)藥物療效等均具有重要的臨床意義，在骨代謝疾病的應(yīng)用中前景廣泛。但是，目前仍有許多關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的疑問(wèn)，包括其在骨重建、骨折愈合中的具體作用機(jī)制等還需進(jìn)一步探究。

關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞；外周血；骨代謝；臨床應(yīng)用

Research Progress of Application of Peripheral Blood Derived Mesenchymal Stem Cells in Bone MetabolismLIXin1,2,HUShi-di1,DAIRu-chun1.(1.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China; 2.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,XiangtanCitySecondPeople′sHospital,Xiangtan411100,China)

Abstract：Peripheral blood mesenchymal stem cells(PBMSCs) is a kind of adult stem cells.Its character is similar to bone marrow mesenchymal stem cells,and the change of bone metabolism caused by PBMSCs abnormal differentiation leads to bone loss.PBMSCs can reflect the status of bone remodeling timely,dynamically,which has important clinical significance for early diagnosis of metabolic bone diseases,prediction of bone loss,monitoring drug efficacy,and has a wide prospect in the clinical application of bone metabolism diseases.But there are still many questions about mesenchymal stem cells,which include the mechanisms in bone remodeling and fracture healing,therefore further research is still needed.

Key words：Mesenchymal stem cells; Peripheral blood; Bone metabolism; Clinical application

收稿日期：2014-09-22修回日期：2014-12-01編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81270960，81070695)；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”(NCET-11-0507)；中南大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(2014zzts359)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.15.003

中圖分類(lèi)號(hào)：R318；R589.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)15-2694-03