周濟宏 洪志堅 胡心寶 解偉光 于 攀 李幼生

(1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院燒傷整形科，江蘇 南京 210002；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍普通外科研究所，江蘇 南京 210002)

腫瘤壞死因子-α削弱谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成的途徑

周濟宏1洪志堅1胡心寶1解偉光1于 攀1李幼生2

(1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院燒傷整形科，江蘇 南京 210002；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍普通外科研究所，江蘇 南京 210002)

目的：研究腫瘤壞死因子-α（TNF-α）對谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成及對細胞膜谷氨酰胺載體ASCT2 mRNA和蛋白表達的影響，揭示TNF-α影響谷氨酰胺促蛋白質(zhì)合成的途徑。方法：30只雄性SD大鼠，隨機分為3組：對照組, 谷氨酰胺組 (Gln組) 和谷氨酰胺+腫瘤壞死因子組 (Gln+TNF-α組)。所有大鼠均行72 h全腸外靜脈營養(yǎng)（TPN）。對照組給予普通TPN；Gln組給予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的腸外營養(yǎng)，谷氨酰胺劑量為0.3 g?kg-1?d-1；Gln+TNF-α組TPN方法同Gln組，并于實驗結束前24 h持續(xù)靜脈滴注TNF-α（5 μg?kg-1?h-1）。所有大鼠均于取材前0.5 h一次性靜脈注射L-15N 亮氨酸1.0 mmol/kg。TPN后72 h分別取血和下肢骨骼肌，測定血漿TNF-α濃度（雙抗體夾心ELISA法）、血漿和骨骼肌Gln濃度（高效液相色譜分析法）、骨骼肌蛋白質(zhì)分數(shù)合成率（質(zhì)譜儀測定后計算）、載體ASCT2 mRNA（RT-PCR方法）及蛋白（Western Blot法）表達水平。結果：Gln+TNF-α組血漿TNF-α濃度顯著高于其他兩組；Gln+TNF-α組血漿及骨骼肌中谷氨酰胺濃度最高；Gln組和Gln+TNF-α組骨骼肌中蛋白質(zhì)合成率均高于對照組，并且Gln組最高，各組間差異顯著（P＜0.01）。對照組ASCT2 mRNA表達最低（P＜0.01），而另兩組間差異無顯著性（P＞0.05）。3組ASCT2蛋白均有表達，Gln組顯著高于對照組和Gln+TNF-α組（P＜0.01）。結論：TNF-α能夠升高大鼠血漿及骨骼肌中谷氨酰胺的濃度，削弱谷氨酰胺的促蛋白質(zhì)合成作用；其途徑是抑制谷氨酰胺載體蛋白的合成，降低了骨骼肌細胞對谷氨酰胺攝入，導致組織蛋白質(zhì)合成下降。

腫瘤壞死因子-α 谷氨酰胺 全腸外營養(yǎng) 蛋白質(zhì)合成率 谷氨酰胺載體 ASCT2

谷氨酰胺（Gln）是健康機體中含量豐富的游離氨基酸，不僅是蛋白質(zhì)合成的原料，還能夠誘導細胞保護，調(diào)節(jié)免疫應答，預防器官損傷。在危重患者中，由于蛋白質(zhì)大量消耗，血中谷氨酰胺濃度至少下降25%～35%[1-2]，這種現(xiàn)象尤其多見于大面積燒傷患者。機體在創(chuàng)傷、感染等應激狀態(tài)時，雖然骨骼肌可以釋放大量谷氨酰胺，為快速增殖細胞提供能量，作為前體合成核苷酸，并調(diào)節(jié)酸堿平衡，但此時仍需補充外源性谷氨酰胺。研究證實，補充外源性谷氨酰胺，能夠有效地預防和治療膿毒癥和其他損傷所誘發(fā)的多器官功能障礙綜合征[1-4]。但近來也有研究顯示，在感染狀態(tài)下，尤其在感染的早期，應用谷氨酰胺后，其在降低重度感染患者病死率、縮短住院時間、減輕炎癥反應、促進感染狀態(tài)下蛋白質(zhì)合成等方面的效果并不理想[5-6]。血液中的谷氨酰胺必須首先順利進入功能細胞才能發(fā)揮作用，而其跨膜轉(zhuǎn)運又必須依賴細胞質(zhì)膜上谷氨酰胺載體的正常結構和功能[7]。TNF-α是膿毒癥的重要介質(zhì)[8]。本研究擬探討TNF-α對谷氨酰胺促蛋白質(zhì)合成的影響及其可能途徑，為提高感染狀態(tài)下谷氨酰胺的療效提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 成年健康雄性封閉群SD大鼠（中國科學院上海實驗動物中心提供），清潔級，體重120～180 g。術前在清潔級大鼠飼養(yǎng)室以標準實驗大鼠全價顆粒飼料（江浦實驗動物飼料廠）飼養(yǎng)至少1周以適應環(huán)境。飼養(yǎng)室溫度18～22 ℃，每日光照12 h（6:00-18:00），自由飲水。 L-15N亮氨酸購于美國劍橋同位素實驗室（Cambridge Isotope Laboratories）；丙氨酰谷氨酰胺二肽、脂肪乳（20%Intralipid）、10%樂凡命（10%Novamin）均購于華瑞制藥有限公司； TNF-α購于美國Peprotechec公司；哺乳動物總蛋白抽提試劑盒購自上海星漢生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 動物分組與處理 30只雄性SD大鼠隨機分為3組：對照組、谷氨酰胺組 (Gln組)和谷氨酰胺+ TNF-α組 (Gln+TNF-α組)。3組大鼠均按照文獻[9]的方法行左頸外靜脈置管并連接旋轉(zhuǎn)輸液裝置，然后置代謝籠中，禁食。手術當天予以5%葡萄糖注射液100 ml/kg靜滴，次日開始經(jīng)頸外靜脈行72 h全腸外營養(yǎng)（TPN），營養(yǎng)液每日使用前配制，配方見表1。每次更換注射器，避免空氣進入管道，輸液管道連接處酒精消毒。對照組行普通TPN；谷氨酰胺組行含有谷氨酰胺（0.3 g?kg-1?d-1，由丙氨酰谷氨酰胺二肽提供）的TPN； Gln+TNF-α組同樣應用含有谷氨酰胺的TPN，但在實驗結束前24 h持續(xù)靜滴TNF-α，速度5 μg?kg-1?h-1。所有大鼠均在取材前0.5 h，一次性靜脈注射示蹤劑L-15N亮氨酸1.0 mmol/kg以測定骨骼肌蛋白質(zhì)合成率。

表1 全腸外營養(yǎng)配方

1.3 標本處理與指標檢測 于TPN 72 h在麻醉狀態(tài)下取大鼠下腔靜脈血5～6 ml，1 500 r/min離心5 min，取血漿，同時取左后肢股四頭肌肌群的肌肉組織2.5～3.0 g，均-20 ℃保存。

1.3.1 血漿TNF-α濃度測定 采用雙抗體夾心ELISA法,試劑盒為上海滬鼎生物科技公司生產(chǎn)。

1.3.2 谷氨酰胺濃度測定 采用高效液相色譜分析法[10]。血漿直接超濾；取肌肉組織0.2 g研磨后用流動相稀釋后超濾去蛋白。取濾液衍生，衍生劑為鄰苯二甲醛（衍生60～90 s），衍生后進樣，根據(jù)峰面積及肌肉的重量計算出谷氨酰胺濃度。

1.3.3 骨骼肌蛋白質(zhì)分數(shù)合成率（FSR）的測定 取骨骼肌2.0 g，液氮冷凍，研磨成粉，按照文獻[10]的方法進行游離及結合氨基酸的分離、制備質(zhì)譜儀測定所需前體及質(zhì)譜儀測定15N豐度，根據(jù)以下公式計算FSR：

其中EB（t）、EB（o）為實驗起始及實驗結束時的結合氨基酸（所測蛋白質(zhì)）豐度，EF(t)系前體池氨基酸豐度。EB（o）系固定值0.364。

1.3.4 谷氨酰胺載體ASCT2 mRNA表達的測定 采用RT-PCR方法。按照Invitrogen 公司的Trizol 操作說明書進行總RNA抽提，紫外分析法測定抽提RNA的濃度；逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，操作按照Promega 公司的M-MLV 操作說明書進行；熒光定量PCR儀（FTC2000， Funglyn Biotech Inc 加拿大）上進行熒光定量PCR反應。ASCT2引物分別是：5’-GCAGCCTAGACCTGGGATCAC-3’（上游引物）及5’-GCGGTCTTTGATTCCCTGAA-3’（下游引物），TaqMan探針為：fam+ATCT TGGGTTCCCGGAGCCAGACAT+tamra (上海閃晶分子生物科技有限公司合成)。實時熒光定量PCR反應在50 μl的反應體系中進行：TaqmanPCR反應通用緩沖液25μl，引物(25 pmol/μl) 0.6 μl×2，探針0.3 μl，cDNA模板1μl，DEPC水22.5 μl。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min，擴增循環(huán) 94℃×20 s，60℃×30 s，共30個循環(huán)。擴增完成后，記錄每組相應的Ct值并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.3.5 ASCT2蛋白表達的測定 采用Western-Blot方法。用抽提試劑盒獲得骨骼肌組織總蛋白，并檢測濃度，取5 μg蛋白裂解液，于100 ℃加熱3 min后，進行常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用質(zhì)量濃度為5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入1:500稀釋的羊抗鼠ASCT2多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），室溫下孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后，加入1:10 000稀釋的驢抗羊IgG-HRP抗體(美國Santa Cruz公司），室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗膜后，ECL法顯色。以Actin作為內(nèi)參照，Quantity One分析軟件（Bio-Rad 1000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA 94547）將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化。

1.4 統(tǒng)計學分析 定量數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩多重比較采用Dunnett's T3 檢驗。采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 血漿TNF-α濃度的變化 TPN后72 h，Gln+TNF-α組血漿TNF-α濃度顯著高于其他兩組（P＜0.01，見表2）。

2.2 血漿和骨骼肌中谷氨酰胺濃度的變化 血漿和骨骼肌中谷氨酰胺濃度均以Gln+TNF-α組最高，Gln組次之，對照組最低，各組間差異顯著（P ＜0. 01，見表2）。

2.3 骨骼肌FSR的變化 Gln組最高，對照組最低，Gln+TNF-α組顯著低于Gln組，各組間差異顯著（P ＜0.05或P ＜0.01，見表2）。

表2 3組血漿TNF-α、谷氨酰胺濃度及骨骼肌Gln濃度和FSR的變化（x±s，n=10）

2.4 TNF-α對ASCT2 mRNA表達的影響 對照組ASCT2 mRNA表達最低，顯著低于其他兩組，Gln+TNF-α組ASCT2 mRNA表達高于Gln組，但差異無顯著性（見圖1）。

圖1 3組骨骼肌ASCT2 mRNA的表達

2.5 TNF-α對ASCT2蛋白表達的影響 各組ASCT2蛋白均得以表達（見圖2），其中對照組顯著低于Gln組和Gln+TNF-α組，Gln組高于Gln+TNF-α組，差異有顯著性（見圖3）。

圖2 3組骨骼肌ASCT2蛋白表達的Western Blot結果

圖3 TNF-α對骨骼肌ASCT2蛋白表達的影響

3 討 論

感染一直是困擾世界人口健康和醫(yī)療質(zhì)量的重大難題，人口老齡化、免疫抑制、多重耐藥等諸多因素，均可導致重度感染的發(fā)生。感染能誘發(fā)發(fā)熱、白細胞升高、低血壓等癥狀，最終導致多器官系統(tǒng)功能衰竭。在住院患者中，感染的發(fā)生率和重度感染(膿毒癥)引起的病死率正在逐年增加。最近的統(tǒng)計表明，膿毒癥直接導致的病死率可高達20% ～50%，而多器官功能障礙綜合征（MODS）正是重癥監(jiān)護病房（ICU）中患者的主要死因[1-3]。因此，如何防治感染一直是醫(yī)學界的一項重要研究課題。

有大量的研究支持在危重患者的治療中使用谷氨酰胺，谷氨酰胺可以降低患者感染發(fā)病率和病死率，并且劑量越大療效越好[2-3]。 但近年來也用一些研究顯示，在感染狀態(tài)下使用谷氨酰胺療效并不理想，增加外源性谷氨酰胺不一定能促進骨骼肌的蛋白質(zhì)合成[5]；為重癥患者補充谷氨酰胺不能對患者的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生影響。Ebach等[8]報道，使用谷氨酰胺只能增加感染大鼠骨骼肌中游離谷氨酰胺的濃度，而不增加蛋白質(zhì)合成。這些研究結果與我們在臨床上觀察到的現(xiàn)象一致[5,10]。

TNF-α是在重度感染中起關鍵作用的因素[7]。本研究中，我們通過給大鼠持續(xù)靜脈滴注TNF-α來模擬重度感染狀態(tài)，可使血漿中TNF-α升高到很高的水平，與感染狀態(tài)相似。我們發(fā)現(xiàn)，使用腫瘤壞死因子和谷氨酰胺可以顯著升高血漿和骨骼肌組織中游離谷氨酰胺的濃度。 同樣在其他模擬感染的試驗中，在感染早期游離谷氨酰胺濃度并不降低，反而升高，這與TNF促蛋白質(zhì)降解有關[11]。就蛋白質(zhì)合成而言，我們發(fā)現(xiàn)，Gln組的FSR較未應用Gln的對照組顯著升高，說明谷氨酰胺可以促進機體蛋白質(zhì)合成，這與其他的實驗結果相符[12]。另外，Gln+TNF-α組FSR明顯低于Gln組，進一步表明谷氨酰胺的這種促蛋白質(zhì)合成的作用可以被TNF-α抑制。可見，感染時，細胞外高濃度谷氨酰胺并不能被很好地利用。

谷氨酰胺首先是蛋白質(zhì)合成的底物[1-3]，細胞外高濃度的谷氨酰胺能否順利進入細胞發(fā)揮作用，取決于載體功能是否正常。我們前期離體研究已經(jīng)證實，TNF-α抑制氨基酸載體對谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運[13]。載體ASCT2是系統(tǒng)ASC的一種載體，對轉(zhuǎn)運谷氨酰胺有高度的親和性，在組織細胞中有廣泛的分布[14-18]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠促進載體ASCT2的mRNA合成，可見其對載體功能的影響并非發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，這和我們的前期離體研究相符[19]。蛋白質(zhì)功能的改變無非兩種途徑，一種是表達量的改變，另一種是其功能位點的構象變化。我們研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子抑制谷氨酰胺載體蛋白的表達，這說明轉(zhuǎn)運載體絕對數(shù)量是下降的，但其表達量的下降幅度并不顯著。我們在小腸研究中卻發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運蛋白數(shù)量并不顯著下降[20]。轉(zhuǎn)運功能的受抑勢必存在著載體蛋白結構的改變。炎癥因子究竟通過何種途徑抑制谷氨酰胺載體蛋白的轉(zhuǎn)運功能，其分子機制仍不清楚。

總之，本研究顯示，炎癥因子能夠抑制谷氨酰胺的促骨骼肌蛋白質(zhì)合成作用，其途徑是炎癥因子抑制氨基酸載體的轉(zhuǎn)運功能，導致谷氨酰胺不能順利進入細胞，這種抑制部分發(fā)生在翻譯水平，當然究竟通過何種途徑來實現(xiàn)，還有待進一步研究證實。

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Study of the effects of tumor necrosis factor-α in decreasing the protein synthesis of skeletal muscle stimulated by glutamine and its pathway in rats

Zhou Jihong*，Hong Zhijian，Hu Xinbao，Xie Weiguang ，Yu Pan，Li Yousheng.

*Department of Burns and Plastic Surgery，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region， Nanjing 210002，Jiangsu，China

Li Yousheng(E-mail: liys@medmail.com.cn)

Objective: To study whether and how tumor necrosis factor-α (TNF-α) affects glutamine-enhanced protein synthesis of skeletal muscle, and the effects of TNF-α on the expression of mRNA and protein of ASCT2, a kind of membrane transportor of glutamine. Methods: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: control group, glutamine group (Gln group,), and Gln+TNF-α group. All rats received total parenteral nutrition (TPN) components for 3 days. The animals of the control group were only supplemented with general TPN, while those in the Gln group were given glutamine-enriched (0.3 g?kg-1?d-1, glutamine was supplied by alanyl glutamine dipeptide ) TPN, and those of the Gln+TNF-α group were supplemented with glutamine-enriched TPN, and then they received intravenous injection of 5 μg?kg-1?h-1of TNF-α in the last 24 hours. In the last 30 minutes of TPN, all rats received intravenous injection of 1.0 mmol/kg of L-15N leucine. The blood and skeletal muscles were sampled 72 hours after TPN, the plasma concentrations of TNF-α, the content of glutamine in plasma and skeletal muscles, the fractional synthesis rate of skeletal muscles, the mRNA and protein expression of ASCT2 were assessed . Results: The plasma level of TNF-α in the Gln+TNF-α group was the highest among 3 groups (P ＜0.01). The concentration of glutamine in plasma and skeletal muscles was more elevated in the Gln+TNF-α group than that in the other two groups (P＜0.01). The fractional synthesis rate of skeletal muscles increased more significantly in the Gln+TNF-α and Gln groups than that in the control group, and it was highest in the Gln group (P＜0.01). The mRNA expressionof ASCT2 in control group was statistically significantly lower than that in the other two groups (P ＜0.01), but the difference was not significant between Gln+TNF-α and Gln groups (P＞0.05). The protein expression level of ASCT2 in Gln group was statistically higher than that in the control and Gln+TNF-α groups (P ＜0.01). Conclusions: TNF-α could increase the concentration of glutamine in plasma and skeletal muscles, attenuate protein synthesis in skeletal muscle stimulated by glutamine in rats. The pathway maybe inhibition of protein synthesis of glutamine transporter by TNF-α, and reduction of the uptake of glutamine into target cells. This inhibition could restrain the protein synthesis.

Tumor necrosis factor-α Glutamine Total parenteral nutrition Fractional synthesis rate Glutamine transporter ASCT2

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 03. 006

2015-04-03)

李幼生，主任醫(yī)師（E-mail:liys@medmail.com.cn）