曹桂秋　劉立志　王貴鵬宣曉崗李玲玲(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院老年病科，新疆　烏魯木齊　8300)

?

阿托伐他汀對兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及斑塊內(nèi)血管新生的影響

曹桂秋劉立志王貴鵬1宣曉崗1李玲玲2
(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院老年病科，新疆烏魯木齊830011)

〔摘要〕目的探討阿托伐他汀對兔動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊穩(wěn)定性及斑塊內(nèi)血管新生的影響。方法將80只新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為無藥物干預(yù)常規(guī)超聲造影組(A組)，無藥物干預(yù)超聲微泡造影組(B組)，阿托伐他汀干預(yù)超聲常規(guī)造影組(C組)，阿托伐他汀干預(yù)超聲微泡造影組(D組)，每組20只;建立AS模型后，利用免疫組化法檢測斑塊組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞分化抗原40配體(CD40L)，第8因子相關(guān)抗原(FVⅢRAg)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3的蛋白表達(dá);利用超聲造影技術(shù)對斑塊進(jìn)行常規(guī)超聲及微泡造影檢查，并采用ACQ分析軟件得到斑塊的始增時(shí)間(AT)、到達(dá)時(shí)間(TTP)、峰值時(shí)間(PI)以及基礎(chǔ)強(qiáng)度(BI)，計(jì)算增強(qiáng)強(qiáng)度(EI);利用病理組織學(xué)檢查以及抗CD34免疫組化染色法，算出微血管密度(MVD)，并與造影參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果所有模型高脂喂養(yǎng)后，相對于A組+B組，C組+D組的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性減輕，且脂質(zhì)沉積和泡沫細(xì)胞也減少;同時(shí)C組+D組AS斑塊內(nèi)VEGF，F(xiàn)VⅢRAg，MMP-3和CD40L的陽性染色面積以及MVB值也均明顯低于A組+B 組(均P＜0. 01);另外D組AS斑塊EI值與MVD值呈正相關(guān)(r=0. 665，P＜0. 01)，高于C組AS的EI值與MVD值相關(guān)性(r=0. 401，P＜0. 01)。結(jié)論阿托伐他汀具有穩(wěn)定AS斑塊的作用，抑制斑塊內(nèi)血管新生可能為其機(jī)制之一，而超聲微泡造影劑有助于評價(jià)AS斑塊新生血管情況。

〔關(guān)鍵詞〕阿托伐他汀;動(dòng)脈粥樣硬化;超聲造影;微泡;斑塊

1新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心內(nèi)科

2新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院超聲科

第一作者:曹桂秋(1972-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病診治方面的研究。

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是引發(fā)急性冠脈綜合發(fā)生的主要機(jī)制〔1〕。有研究發(fā)現(xiàn)，AS斑塊內(nèi)有出現(xiàn)的病理性新生血管，它可能有助于促進(jìn)粥樣硬化的發(fā)展，甚至導(dǎo)致斑塊破裂或斑塊內(nèi)出血〔2〕。阿托伐他汀對AS斑塊具有穩(wěn)定的作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其能影響斑塊內(nèi)血管新生〔3〕，但相關(guān)報(bào)道較少。而超聲造影劑作為血池顯影劑可以定量評價(jià)斑塊內(nèi)新生血管數(shù)量以及斑塊穩(wěn)定性。本研究通過使用高脂飲食及球囊導(dǎo)管血管損傷術(shù)制作兔腹主動(dòng)脈AS斑塊模型，并利用超聲造影技術(shù)及免疫組化法進(jìn)行定量分析，旨在探討阿托伐他汀對AS模型斑塊的穩(wěn)定性以及其對斑塊內(nèi)新生血管的影響。

1　資料與方法

1. 1一般資料健康新西蘭兔80只，體重2. 0～2. 5 kg，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，將其隨機(jī)分為無藥物干預(yù)常規(guī)超聲造影組(A)、無藥物干預(yù)超聲微泡造影組(B)、阿托伐他汀干預(yù)超聲常規(guī)造影組(C)、阿托伐他汀干預(yù)超聲微泡造影組(D)，各20只;高脂飼料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(含1. 5%膽固醇);阿托伐他汀由杭州默沙東制藥有限公司提供(批號: 07455);免疫組化一抗工作液由北京博奧森公司提供; BX51光學(xué)顯微鏡(日本，Olympus公司); GE LOGIQ9超聲診斷儀(美國，GE公司)。

1. 2建立兔腹主AS斑塊模型所有實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，均給予高脂飼料100 g/d，自由進(jìn)食攝水，喂養(yǎng)2 w后進(jìn)行腹主動(dòng)脈球囊導(dǎo)管血管損傷術(shù):耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，取右股動(dòng)脈搏動(dòng)最強(qiáng)處鈍性分離及穿刺，將2. 5 mm×15 mm的球囊導(dǎo)管送入腹主動(dòng)脈處，推注7～8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓充盈球囊反復(fù)回拉造成動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，并將結(jié)扎傷口逐層進(jìn)行逢合。術(shù)后肌肉注射8萬單位的慶大霉素以預(yù)防感染。C組及D組在造模后在高脂飼料中拌入阿托伐他汀5 mg·kg-1·d-1，繼續(xù)喂養(yǎng)6 w。

1. 3超聲檢查使用GE Logiq 9超聲診斷儀，9 L探頭，頻率8 MHz。劍下掃查，待腹主動(dòng)脈圖像穩(wěn)定后，B組及D組經(jīng)兔耳緣靜脈彈丸式注入超聲微泡造影劑(聲諾維)，按0. 02 ml/kg劑量;而A組及C組再注入SonoVue造影劑0. 1 ml后，啟動(dòng)contrast條件開始同步計(jì)時(shí)，觀察斑塊增強(qiáng)特征，對過程進(jìn)行圖像動(dòng)態(tài)存儲，在脫機(jī)狀態(tài)下利用聲學(xué)定量分析軟件(ACQ)對圖像進(jìn)行分析。記錄兔腹主動(dòng)脈斑塊超聲造影感興趣區(qū)(ROI)，并使用時(shí)間-強(qiáng)度曲線(TIC)將兔腹主動(dòng)脈斑塊的到達(dá)時(shí)間(AT)、達(dá)峰時(shí)間(TTP)、峰值強(qiáng)度(PI)以及斑塊的基礎(chǔ)強(qiáng)度(BI)進(jìn)行記錄，計(jì)算增強(qiáng)強(qiáng)度(EI，EI=PI－BI)，并將EI值與免疫組織化學(xué)量化結(jié)果做相關(guān)性分析。

1. 4免疫組化檢測微血管密度(MVD)測定:所有實(shí)驗(yàn)兔模型檢查后立刻處死，用10%甲醛固定目標(biāo)斑塊標(biāo)本，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備成4 μm厚連續(xù)切片，并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察動(dòng)脈斑塊形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。病理檢查后，用抗CD34單克隆抗體標(biāo)記血管中層、斑塊基底部及纖維帽與斑塊肩部的內(nèi)皮細(xì)胞，然后在200倍顯微鏡視野下計(jì)數(shù)每一視野的微血管數(shù)。MVD的測定方法: CD34陽性標(biāo)準(zhǔn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色染色，將染成棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞簇或單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞視為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，結(jié)構(gòu)只要不相連，其分支結(jié)構(gòu)也視為1個(gè)血管計(jì)數(shù)。微血管計(jì)數(shù)方法:首先在低倍鏡(40倍)下對切片進(jìn)行觀察，找到3個(gè)血管染色最密集的地方，然后在高倍鏡(200倍)下對這3個(gè)視野分別進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，取平均值作為該切片的MVD值。

AS斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、第8因子相關(guān)抗原(FVⅢRAg)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3及白細(xì)胞分化抗原40配體(CD40L)的蛋白測定: 60℃條件下靜置切片1 h，使用二甲苯以及梯度乙醇進(jìn)行脫蠟處理，使用5%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min。4℃條件下采用一抗孵育過夜，再采用二抗結(jié)合30 min，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色以及HE復(fù)染，脫水后用中性樹膠進(jìn)行封片。DAB顯色為棕黃色顆粒狀表示陽性結(jié)果，而斑塊內(nèi)VEGF、FVⅢRAg、MMP-3以及CD40L陽性的區(qū)域面積占整個(gè)斑塊面積的比例可利用IPP軟件得到。

1. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17. 0軟件進(jìn)行分析t檢驗(yàn)、Person相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2. 1一般情況在球囊導(dǎo)管血管損傷術(shù)操作過程中有4只兔死亡，而術(shù)后3只兔發(fā)生感染死亡，3只兔因飼料沒有食用完而退出實(shí)驗(yàn)，其余70只兔均完成實(shí)驗(yàn)，最終A、B、C、D組納入分析的實(shí)驗(yàn)兔分別為18、17、18、17只。

2. 2病理形態(tài)學(xué)改變所有模型高脂喂養(yǎng)后，HE染色顯示A 組+B組腹主動(dòng)脈內(nèi)有明顯的AS斑塊形成，內(nèi)膜增厚明顯且含有大量泡沫細(xì)胞，并形成了纖維帽，斑塊內(nèi)可見膽固醇結(jié)晶，而進(jìn)行C組+D組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性減輕，且脂質(zhì)沉積和泡沫細(xì)胞也減少。

2. 3各組免疫組化結(jié)果改變所有模型的AS斑塊內(nèi)均發(fā)現(xiàn)很多棕黃色顆粒，且明顯聚集于斑塊肩部及基底部，而C組+D組棕黃色顆粒比A組+B組少。同時(shí)C組+D組AS斑塊內(nèi)VEGF、FVⅢRAg、MMP-3和CD40L的陽性染色面積均比A組+ B組明顯減少(均P＜0. 01)。另外C組+D組MVB值明顯低于A組+B組(P＜0. 01)。見表1。

表1　各組斑塊組織免疫組化指標(biāo)比較(x ±s，n=35)

2. 4斑塊超聲分子顯像EI與免疫組化法測定的MVD結(jié)果相關(guān)性分析8 w后，D組AS斑塊EI值與MVD值呈線性正相關(guān)(r= 0. 665，P＜0. 05)，而PI、AT、TTP值與MVD值均無相關(guān)性(r=0. 259，0. 088，－0. 112，均P＞0. 05); C組AS斑塊EI值與MVD值也呈線性正相關(guān)(r = 0. 401，P＜0. 01)，但相關(guān)性低于D組。

3　討論

AS是影響人類健康的主要疾病，絕大多數(shù)患者無任何前驅(qū)表現(xiàn)，常死于急性心血管事件。研究顯示，AS斑塊破裂和血栓形成是導(dǎo)致急性心血管病事件的主要原因，而斑塊的易損性及不穩(wěn)定斑塊破裂是導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征的重要因素之一，及時(shí)判斷AS程度已成為預(yù)防事件發(fā)生的重點(diǎn)〔4〕。另外有研究顯示斑塊內(nèi)大量新生血管的出現(xiàn)與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)〔5〕。他汀類藥物在降低冠心病的發(fā)病率和死亡率方面的意義非常大，其不僅能降低低密度脂蛋白膽固醇，還具有不依賴于降脂作用的心血管保護(hù)效應(yīng)，如穩(wěn)定易損斑塊、改善內(nèi)皮功能、抗感染、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降壓、抑制血栓形成等〔6〕。研究表明阿托伐他汀在抗AS的形成及發(fā)展方面具有非常重要的作用〔7〕。

MMPs是一組可消化細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，能降解纖維帽成分造成結(jié)構(gòu)破壞，從而有助于促進(jìn)斑塊破裂，是造成AS斑塊不穩(wěn)定的主要原因〔8〕。而CD40L可表達(dá)于AS斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)MMPs〔9〕。本研究結(jié)果提示阿托伐他汀具有抑制斑塊內(nèi)CD40L的表達(dá)，進(jìn)而降低MMP-3的表達(dá)，從而減少斑塊局部的基質(zhì)降解，有助于保持斑塊的穩(wěn)定性。而VEGF是一種生長因子，對血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂具有促進(jìn)作用，研究證實(shí)其能明顯表達(dá)于在AS斑塊中，對斑塊的發(fā)生與發(fā)展可能有促進(jìn)作用〔10〕。而FVⅢRAg是一種糖蛋白，可在內(nèi)皮細(xì)胞表面廣泛表達(dá)，一般存在于小的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管尚未形成管腔的分支，是新生血管內(nèi)皮的特異性標(biāo)志物〔11〕。VEGF和FVⅢRAg在血管形成過程起著非常重要的作用。本研究結(jié)果說明阿托伐他汀可一定程度抑制VEGF和FVⅢRAg在實(shí)驗(yàn)兔AS斑塊模型中的表達(dá)，同時(shí)能降低斑塊內(nèi)MVB值。另外病理形態(tài)觀察結(jié)果顯示，在高脂飲食的情況下，進(jìn)行阿托伐他汀干預(yù)的模型其內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性較未進(jìn)行阿托伐他汀干預(yù)的模型減輕，且脂質(zhì)沉積和泡沫細(xì)胞也減少，表明阿托伐他汀有助于改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，對AS斑塊的控制具有一定作用。

超聲造影可用來直觀AS斑塊內(nèi)微血管分布情況，可用來評價(jià)AS斑塊穩(wěn)定程度，超聲微泡造影劑是一種新型超聲造影劑，相對于常規(guī)造影劑具有更好的顯影效果。蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等生物成分構(gòu)成其外殼，而內(nèi)部使用空氣或者惰性氣體進(jìn)行填充，在人體注入后，周圍血液與微泡內(nèi)氣體形成的界面可最大程度地將入射超聲(＞99%)反射回來，從而增強(qiáng)超聲反射信號的強(qiáng)度〔12〕。因?yàn)槲⑴莸姆瓷湫盘枮榉蔷€性回聲，通過選擇性接收微泡的非線性回聲或抵消組織內(nèi)的線性回聲，可使超聲顯像的對比度和分辨率明顯增強(qiáng)。本研究說明超聲微泡造影劑相對于常規(guī)超聲造影劑更有助于定量評價(jià)斑塊的增強(qiáng)情況，從而更有利于定量評價(jià)AS斑塊新生血管密度。

綜上所述，阿托伐他汀抑制斑塊內(nèi)血管的新生可能是其穩(wěn)定AS斑塊的機(jī)制之一。另外超聲微泡造影可定量測量斑塊EI，其與MVD具有良好相關(guān)性，可用于定量評價(jià)斑塊內(nèi)MVD。

4參考文獻(xiàn)

1劉揚(yáng)，李招兵，沈嚴(yán)嚴(yán)，等.不同他汀類藥物對動(dòng)脈粥樣硬化療效的比較研究〔J〕．重慶醫(yī)學(xué)，2011; 40(6): 587-9.

2李超倫.超聲造影評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊新生血管形成的實(shí)驗(yàn)與臨床研究〔D〕．上海:復(fù)旦大學(xué)博士論文，2011.

3蔡敏，馬璟曦，羅春陽，等.阿托伐他汀對急性腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響〔J〕．重慶醫(yī)學(xué)，2012; 41(7): 656-7，660.

4王錦溪，李虹偉.亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化的研究進(jìn)展〔J〕．中國全科醫(yī)學(xué)，2013; 16(24): 2790-2.

5孫杰.超聲造影評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯像強(qiáng)度與新生血管密度的關(guān)系及其影響因素的研究〔D〕．武漢:華中科技大學(xué)博士論文，2013.

6張亞光，詹曉蓉. 2型糖尿病合并下肢動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素〔J〕．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014; 14(5): 986-8.

7劉英，劉惠亮.阿托伐他汀多效性研究進(jìn)展〔J〕．中國全科醫(yī)學(xué)，2013; 16(6): 601-4.

8吳陽，張東輝，方衛(wèi)華，等.基質(zhì)金屬蛋白酶3與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系研究的進(jìn)展〔J〕．心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2014; 23(1): 104-6.

9談禮武. CD40/CD40L系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化及心血管事件中的作用〔J〕．醫(yī)學(xué)綜述，2013; 19(8): 1372-5.

10皇甫斌.血管內(nèi)皮生長因子在動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上缺血性腦卒中模型大鼠腦組織中的表達(dá)研究〔D〕．太原:山西醫(yī)科大學(xué)碩士論文，2012.

11李丹，李玉潔，楊慶，等.血管內(nèi)皮功能障礙與動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展〔J〕．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012; 18(8): 272-6.

12劉興釗，任建麗，王志剛，等.超聲微泡造影劑在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病治療中的應(yīng)用進(jìn)展〔J〕．臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志，2012; 14(7): 471-3.

〔2015-02-16修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目:新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No．2014211C124)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5717-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 015

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R743