張海晨 張曉東

(玉溪師范學院資源環(huán)境學院,云南玉溪653100)

三種滇龍膽葉片總RNA提取方法的比較①

張海晨 張曉東②

(玉溪師范學院資源環(huán)境學院,云南玉溪653100)

滇龍膽;總RNA;提取方法;異硫氰酸胍法;試劑盒法

分別使用傳統(tǒng)異硫氰酸胍法和Takara公司的兩種試劑盒來提取滇龍膽幼葉的總RNA,比較所提取RNA質(zhì)量和純度.結(jié)果表明,三種方法各有優(yōu)缺點,但MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取的RNA質(zhì)量好、純度高、提取效率高,且無基因組污染,優(yōu)于其他兩種方法,而異硫氰酸胍法從經(jīng)濟的角度考慮則最為實惠.

滇龍膽是多年生草本植物,主要產(chǎn)自云南、四川、湖南、廣西等地[1].滇龍膽具有悠久的藥用歷史,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主骨間寒熱,驚癇邪氣,續(xù)絕傷,定五臟,殺蠱毒”.龍膽野生于海拔400～1 700 m的山坡草甸、山坡及灌木從中,喜陽光充足,較濕潤的地方,喜涼爽氣候,耐寒[2,3].文獻檢索結(jié)果表明,目前在分子方面對滇龍膽的研究很少.然而,要從分子生物學角度研究滇龍膽,首先要對滇龍膽的總RNA進行提取,獲得純度高、完整性好的RNA.本研究分別采用三種方法提取滇龍膽葉片中的總RNA,并通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,比較三種方法的優(yōu)缺點.

1 材料與方法

實驗材料 滇龍膽無菌苗培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基培養(yǎng),光周期為16 h光照、8 h黑暗.取滇龍膽幼葉,于天平中準確稱量0.1 g進行總RNA的提取.實驗所用研缽、研杵、離心管、槍頭等均用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)進行處理.

實驗方法 采用異硫氰酸胍法、試劑盒法1、試劑盒法2三種方法來提取滇龍膽葉片中的總RNA.

(1)異硫氰酸胍法提取總RNA.其提取步驟如下：①稱取0.1 g葉片,迅速放入預先預冷的研缽中,加液氮研磨,直到研磨成粉末狀.②加入0.9 m L異硫氰酸胍提取液(4M異硫氰酸胍,25m M檸檬酸三鈉, 0.5%(w/v)十二烷基肌氨酸,2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮),繼續(xù)研磨成水狀,轉(zhuǎn)移至1.5 m L離心管,輕輕搖動離心管使混合均勻.③加入1/10體積的2 M醋酸鈉(p H=4.2)、氯仿0.3 m L,合蓋后劇烈震蕩2 min,然后冰浴5 min.④4℃、12 000 rpm離心15 min后,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中;⑤加入等體積氯仿,合蓋后劇烈震蕩2 min,然后冰浴5 min.⑥4℃、12 000 rpm離心15 min后,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中;⑦加入等體積異丙醇,在-20℃沉淀RNA 30 min,4℃、12 000 rpm離心20 min.⑧RNA沉淀經(jīng)75%乙醇清洗兩次后,常溫干燥5 min;⑨加入20μl DEPC處理水徹底溶解RNA.⑩采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA.

(2)試劑盒法1：RNAiso for Polysacchariderich Plant Tissue,提取步驟如下：①取0.1 g樣品,使用液氮研磨至粉末狀.②加入1 m L提取液,繼續(xù)研磨至水狀,轉(zhuǎn)移至1.5 m L離心管中.③4℃、12 000 g離心5 min.④吸取上清液至新的1.5 m L離心管中.⑤向上述上清液中加入1/5體積的5 M NaCl和3/5體積的氯仿.蓋緊離心管蓋,用手劇烈振蕩15 s,室溫靜置5 min.⑥4℃、12 000 g離心15 min.⑦吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中,加入1/2體積的異丙醇和1/2體積的高鹽溶液,顛倒混勻后,室溫靜置10 min.⑧4℃、12 000 g離心15 min.⑨棄上清,加入75%乙醇1 m L清洗沉淀.⑩室溫干燥沉淀5 min后,使用20μlRNase-free水溶解沉淀,再采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA.

(3)試劑盒法2：Takara MiniBEST Plant RNA Extraction Kit,實驗步驟如下：①稱量0.1 g樣品,使用液氮研磨成粉末狀,加入到450μl Buffer RL繼續(xù)研磨成水狀,然后轉(zhuǎn)移至1.5 m L離心管中.②4℃、12 000 rpm離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 m L離心管中,加入上清液1/2體積的無水乙醇,混勻.③立即將混合液轉(zhuǎn)入到RNA Spin Column中,常溫12 000 rpm離心1 min,棄濾液.④將500μl的Buffer RWA加入RNA Spin Column中,常溫12 000 rpm離心30s,棄濾液.⑤將600μl的Buffer RWB加入RNA Spin Column中,常溫12 000 rpm離心30s,棄濾液.⑥向RNA Spin Column膜中央加入50μl DNase I反應(yīng)液,室溫靜置15 min.⑦向RNA Spin Column膜中央加入350μl的Buffer RWB,常溫12 000 rpm離心30s,棄濾液.⑧重復步驟⑤,將RNA Spin Column重新安置于2 m L Collection Tube上,常溫12 000 rpm離心2 min.⑨將RNA Spin Column安置于1.5 m L離心管上,在RNA Spin Column膜中央處加入30μl的0.1%DEPC處理水,室溫靜置5 min.⑩常溫12 000 rpm離心2 min洗脫總RNA,采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA.

2 結(jié)果和分析

使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,結(jié)果如附圖.由附圖可知,三種方法提取植物的總RNA在質(zhì)量方面都不錯,條帶清晰,28S的亮度是18S的亮度的兩倍以上,證明所提取的RNA完整度較好.

附圖 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

但是,三種方法都有各自的優(yōu)缺點.(1)使用異硫氰酸胍法提取總RNA時,其步驟比較繁瑣,稍有操作不當就可能前功盡棄,粗提的總RNA中含有較多的基因組DNA(附圖A),需要進一步除去基因組的步驟,耗時費力.但異硫氰酸胍法的優(yōu)點是成本低、提取量可大可小.(2)RNAiso for Polysaccharide-richPlant Tissue試劑中含有大量的還原劑,可避免多酚類物質(zhì)在提取過程中被氧化而導致RNA的降解;該試劑不含有苯酚等揮發(fā)性有毒成份,對實驗人員毒害性較小.但該試劑盒提取的總RNA中也含有基因組(附圖B),也要進行除基因組的步驟,步驟繁瑣,但其優(yōu)點是提取出的總RNA的量大.(3)MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒具有高效、快速、方便之特點,操作時間也短;提取過程中無需苯酚氯仿抽提等步驟.利用該試劑盒提取的總RNA純度高,基本不含有蛋白質(zhì)及基因組DNA的污染.但其缺點是價格較高.MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒法的提取結(jié)果見(附圖C).

3 討 論

目前,關(guān)于RNA的提取方法有很多種,但每種方法都有其優(yōu)缺點.但總體看,本文所采用的三種方法提取出的總RNA的質(zhì)量和純度均能滿足一般的分子操作的要求.

在分子實驗中,獲得純度高、完整性好的RNA是實驗成功的前提.提取得到的RNA可以直接用于Northern雜交、斑點雜交、m RNA純化、體外翻譯、RNA分解酶的保護分析、RT-PCR、Real Time RTPCR、構(gòu)建c DNA文庫等各種分子生物學實驗.在RNA提取和檢測過程中,外源性RNase主要來自所用的器皿、緩沖液和移液器等,因此在實驗過程中要注意徹底去除外源RNase的污染.

滇龍膽是云南的地道藥材,但由于其市場需求不斷增大且其生長緩慢,造成人為濫采濫挖,進而導致野生滇龍膽數(shù)量日漸減少,所以保護野生龍膽刻不容緩[4].

[1]楊雁,邵愛娟,金航,等.云貴高原滇龍膽不同居群形態(tài)特征變異研究[J].中草藥,2012,43(8)：1604-1610.

[2]唐榮平,蘇漢林,王建光,等.滇龍膽草資源調(diào)查及繁殖特性研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學報,2012(5)：460-463.

[3]張金渝,沈濤,楊維澤,等.云南道地藥材滇龍膽資源調(diào)查與評價[J].植物遺傳資源學報,2012(5)：890-895.

[4]唐榮平,蘇漢林,陽小勇,等.滇西南藥用植物滇龍膽草的致危因素和保護策略探討[J].山地農(nóng)業(yè)生物學報,2013 (5)：445-447,470.

Comparison of Three Methods for Extraction of Total RNA in Gentianarigescens Leaf

ZHANG Haichen ZHANG Xiaodong
(College of Resources and Environment,Yuxi Normal University,Yuxi,Yunnan 653100,China)

Gentiana rigescens;total RNA;extraction;guanidine thiocyanate;method of kits

With young leaves of Gentianarigescens as experiment material,its total RNA was extracted by the traditional method of guanidine thiocyanate and two kits of TaKaRa Company.The quality and purity of the total RNA were compared. Results showed that the method of guanidine thiocyanate was the most economical and the Mini BEST Plant RNA Extraction kit was superior to the other two methods because its resulting RNA is of high quality and purity,and it is highly efficient and without genomic DNA contamination.

張海晨,研究方向：植物分子生物學.

O157.1

A

1009-9506(2015)08-0026-03

2015年2月19日

云南省大學生創(chuàng)新項目,編號：201411390001.

②通信作者：張曉東,博士,研究方向：植物代謝基因工程.Email：zxd95@126.com.