溫旭智 楊覓 胡靜 任偉 劉寶瑞 錢曉萍

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心，江蘇南京210008

載體紅細(xì)胞腫瘤治療應(yīng)用研究進(jìn)展△

溫旭智 楊覓 胡靜 任偉 劉寶瑞 錢曉萍#

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心，江蘇南京210008

目前隨著人們對(duì)疾病治療的深入研究，藥物載體漸漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，特別是在抗腫瘤藥物載體方面，載體紅細(xì)胞就是其中一種。國(guó)內(nèi)外因其循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、生物相容性、生物可降解性等優(yōu)勢(shì)對(duì)其進(jìn)行深入的研究。本文就目前國(guó)內(nèi)外載體紅細(xì)胞抗腫瘤研究及應(yīng)用進(jìn)展方面做簡(jiǎn)要綜述。

紅細(xì)胞；藥物載體；抗腫瘤

目前惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，發(fā)病年齡也呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，因此對(duì)腫瘤學(xué)方面的研究也更加被人們所重視。然而人們對(duì)惡性腫瘤的研究已不僅局限在治療方面，更體現(xiàn)在腫瘤藥物的使用。腫瘤藥物的作用往往在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體增殖旺盛的細(xì)胞，如骨髓細(xì)胞也有一定的影響。因此使用高效、低毒藥物載體運(yùn)送藥物，是降低藥物不良反應(yīng)、減少藥物劑量、提高藥物療效的最佳方法。

近二十年來，關(guān)于藥物載體的研究顯示，載體紅細(xì)胞因具有良好生物相容性、生物可降解性、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)而備受關(guān)注。另外，紅細(xì)胞作為載體有以下優(yōu)勢(shì)：資源豐富、易獲得；具有較大的表面積和體積，為藥物包載提供了大量的空間，提高載藥率；外觀為雙凹形，具有極大的變形能力，可使其順利通過直徑僅3～4μm的毛細(xì)血管[1-3]。因此，人們將紅細(xì)胞作為載體進(jìn)行了更深入的研究，發(fā)現(xiàn)通過從生物體血液樣本中將紅細(xì)胞分離出來，采用不同技術(shù)將藥物等包埋入紅細(xì)胞即可形成載體紅細(xì)胞，并可將載體紅細(xì)胞回輸?shù)饺?、生物體內(nèi)。在眾多研究中也不乏對(duì)抗腫瘤藥物包埋及應(yīng)用的研究。現(xiàn)將載體紅細(xì)胞抗腫瘤研究及應(yīng)用總結(jié)如下。

1 載體紅細(xì)胞的制備

按照載體紅細(xì)胞制備原理，目前載抗腫瘤藥物紅細(xì)胞載藥體系的制備可分為兩類，包括：細(xì)胞內(nèi)包埋型、細(xì)胞膜連接型，具體總結(jié)如下[4-7]。

1.1 細(xì)胞內(nèi)包埋型

此類細(xì)胞內(nèi)包埋型是指通過改變一定的外界條件或紅細(xì)胞的某種性質(zhì)使被包載的藥物進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，從而形成載體紅細(xì)胞。具體方法包括，以滲透壓改變?yōu)榛A(chǔ)的制備方法有：低滲稀釋法、低滲溶血法、低滲預(yù)膨脹法、低滲透析法。此類方法原理為：當(dāng)紅細(xì)胞處于輕度低滲（約為150 Osmmol/kg H2O）的環(huán)境中，外界水分可進(jìn)入紅細(xì)胞使之發(fā)生可逆性膨脹至原體積的125%，使紅細(xì)胞變?yōu)闄E圓形，達(dá)到溶血臨界點(diǎn)時(shí)，紅細(xì)胞膜上一些直徑為20～50 nm的孔隙將短暫開放，藥物可經(jīng)這些孔隙進(jìn)入紅細(xì)胞腔，而當(dāng)周圍環(huán)境恢復(fù)等滲狀態(tài)時(shí)，紅細(xì)胞又可恢復(fù)原來狀態(tài)，細(xì)胞膜上的孔隙也將恢復(fù)，藥物即包載于紅細(xì)胞內(nèi)。低滲稀釋法、低滲溶血法的包載率、利用率低，同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞損傷較大；而低滲預(yù)膨脹法、低滲透析法是目前常用的兩種包載方法，其包埋效果好、細(xì)胞恢復(fù)好。其中低滲透析法可通過專門的設(shè)備大規(guī)模地制備載體紅細(xì)胞，適合在基層血站或醫(yī)院輸血科推廣使用；而低滲預(yù)膨脹法操作更加簡(jiǎn)單，同時(shí)也是此類方法中包載率最高的。另外此類方法中還包括：二甲亞砜誘導(dǎo)的滲透壓脈沖法、介電張力法、化學(xué)干擾法、以及脂質(zhì)體、囊泡、細(xì)胞融合法等，其中細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPP）介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)陷法[8]，這是目前載體紅細(xì)胞抗腫瘤研究中比較新穎的載藥方法，具體是利用細(xì)胞穿膜肽攜帶大分子物質(zhì)直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。這種方法避免了對(duì)細(xì)胞膜化學(xué)或物理性質(zhì)的損傷及紅細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)的丟失。目前在紅細(xì)胞載體方面運(yùn)用成功的有，通過CPP介導(dǎo)攜帶門冬酰胺酶進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)的載藥方法，主要應(yīng)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病。

1.2 細(xì)胞膜連接型

此類表面連接方式可以減少對(duì)載體紅細(xì)胞的損傷及對(duì)生物相容性的影響，特異性較高。主要包括：紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）介導(dǎo)連接[9]、紅細(xì)胞表面補(bǔ)體受體Ⅰ型（E-CR1）介導(dǎo)連接[10]、經(jīng)化學(xué)鍵連接等。其中，藥物作為配體與載體紅細(xì)胞表面修飾的抗體結(jié)合，Mukthavaram等[11]指出，以抗CD20抗體修飾載體紅細(xì)胞，并將利妥昔單抗與抗CD20抗體結(jié)合形成利妥昔單抗載體紅細(xì)胞，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明利妥昔單抗載體紅細(xì)胞相對(duì)于利妥昔單抗脂質(zhì)體對(duì)表達(dá)CD19+/CD20+/CD45+的人淋巴瘤細(xì)胞具有較高抑制率，甚至高于90%。

2 載體紅細(xì)胞的修飾

很多抗腫瘤藥物載體不能發(fā)揮很好的優(yōu)勢(shì)，主要原因是缺乏靶向性、無法控釋藥物等。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，對(duì)載體紅細(xì)胞進(jìn)行修飾能夠獲得良好的生物靶向性，并且通過不同的修飾方法可選擇性地作用于不同器官，同時(shí)可以提高載體紅細(xì)胞的穩(wěn)定性及控制藥物的釋放。修飾方法主要包括：戊二醛、帶3蛋白（Band3）交聯(lián)試劑、變性處理、磁化[12]等，其中在抗腫瘤研究方面，戊二醛及帶3蛋白（Band3）交聯(lián)試劑值得進(jìn)一步探討，具體分析如下。

2.1 戊二醛

戊二醛為常用的細(xì)胞交聯(lián)和固定劑，其能夠與細(xì)胞膜上的蛋白交聯(lián)，增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而避免紅細(xì)胞溶血，也可減緩藥物從細(xì)胞內(nèi)流失，同時(shí)具有一定靶向性[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高濃度戊二醛處理過的載體紅細(xì)胞靶向定位于肝臟，而低濃度戊二醛處理過的載藥紅細(xì)胞則靶向定位于脾臟。吳江等[14]實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)0.25%戊二醛溶液處理的載長(zhǎng)春新堿紅細(xì)胞藥物釋放明顯減慢，相對(duì)于未處理的紅細(xì)胞，長(zhǎng)春新堿的釋放速度下降了70%以上。但經(jīng)此法處理的載體紅細(xì)胞滲透脆性增加，細(xì)胞變形能力降低，不易通過細(xì)小毛細(xì)血管，限制了其應(yīng)用。

2.2 帶3蛋白（Band3）交聯(lián)試劑

帶3蛋白包括有BS3[bis（sulfosuccinimidyl）suberate，雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽]、ZnCl2、DTSP [3，3′-二流代雙（磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯）]。在衰老或變性紅細(xì)胞膜上帶3蛋白交聯(lián)成簇，提高自身免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）的連接能力，更易被巨噬細(xì)胞吞噬。因此，帶3蛋白交聯(lián)試劑處理的載體紅細(xì)胞具有巨噬細(xì)胞靶向性。Lotero等[15]用BS3處理分別攜帶依托泊苷的載體紅細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)提示巨噬細(xì)胞吞噬率從3%提高到11%，并且經(jīng)帶3蛋白與巨噬細(xì)胞形成牢固連接，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示處理后的紅細(xì)胞具有肝靶向性。

3 載體紅細(xì)胞藥物包載

隨著載體紅細(xì)胞在藥物包載方面的研究逐漸深入，載體紅細(xì)胞成功包載的藥物種類也隨之增多，包括細(xì)胞抑制劑、抗生素、激素、維生素、疫苗、酶類、嗎啡、苯丙氨酸解氨酶等[16-19]，其中載門冬酰胺酶紅細(xì)胞已應(yīng)用于臨床治療急性淋巴細(xì)胞白血病[20]，載體紅細(xì)胞包載的抗腫瘤藥物也有很多，以下是近幾年研究較多的載體紅細(xì)胞包載的抗腫瘤藥物。

3.1 長(zhǎng)春新堿

施瑩等、吳江等[21-22]對(duì)載體紅細(xì)胞包載長(zhǎng)春新堿做了一系列臨床前的研究。運(yùn)用改良的低滲預(yù)膨脹法成功將長(zhǎng)春新堿包載入載體紅細(xì)胞中，并對(duì)載長(zhǎng)春新堿紅細(xì)胞特性進(jìn)行了一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)證明紅細(xì)胞總載藥率為（61.42± 3.69）%，載體紅細(xì)胞回收率為（90.61±4.95）%。載體紅細(xì)胞滲透脆性減低，形態(tài)無明顯變化，體積略有增大與載藥量成正比，藥物釋放緩慢，4 h連續(xù)釋放率為（11.35±1.65）%，可穩(wěn)定貯存5 d。對(duì)于載長(zhǎng)春新堿紅細(xì)胞體內(nèi)特性的研究，在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了長(zhǎng)春新堿組、長(zhǎng)春新堿載藥紅細(xì)胞組、未載藥紅細(xì)胞組和陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，長(zhǎng)春新堿載藥紅細(xì)胞組在血漿中濃度穩(wěn)定而持久，72 h后仍可測(cè)出，藥物半衰期達(dá)4.1 h，是長(zhǎng)春新堿組的2.68倍。載藥紅細(xì)胞在肝臟及腫瘤中的濃度和穩(wěn)定性均高于游離藥物，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，這種優(yōu)勢(shì)也愈加顯著。載長(zhǎng)春新堿紅細(xì)胞組對(duì)小鼠移植瘤抑瘤率達(dá)42.42%，是長(zhǎng)春新堿組的2.43倍，并且小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯大于長(zhǎng)春新堿組。綜上說明紅細(xì)胞可用來包載長(zhǎng)春新堿，包載率高，生物學(xué)特性無明顯改變；增強(qiáng)了抗腫瘤效果，延緩藥物釋放，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間；增強(qiáng)了藥物向肝臟及腫瘤的靶向聚集，減少了不良反應(yīng)。

3.2 甲氨蝶呤

袁盛華等[23]對(duì)紅細(xì)胞包載甲氨蝶呤做了臨床前研究。利用高滲法包載甲氨蝶呤，包封率最高達(dá)41.58%。在成功包載后進(jìn)行一系列體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，提示載甲氨蝶呤紅細(xì)胞相對(duì)于裸藥甲氨蝶呤血藥濃度高峰從（13.6±3.7）mg/L下降至（2.7±1.2）mg/L，半衰期從（3.9±0.8）h延長(zhǎng)至（13.5±2.0）h，說明載甲氨蝶呤紅細(xì)胞具有緩釋作用。而在其不良反應(yīng)研究中對(duì)肝癌模型小鼠肝腎功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)于小鼠靜脈給予載甲氨蝶呤紅細(xì)胞后，其丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清尿素氮（BUN）及肌酐（Scr）水平均較裸藥甲氨蝶呤下降，且接近正常水平，說明載甲氨蝶呤紅細(xì)胞對(duì)肝腎具有保護(hù)作用，相對(duì)于包載前大大提高了安全性。

3.3 紫杉醇

Harisa等[24]針對(duì)紅細(xì)胞包載紫杉醇進(jìn)行了研究。該實(shí)驗(yàn)通過低滲預(yù)膨脹法將紫杉醇包載入紅細(xì)胞中，包載率達(dá)到46.36%，且載紫杉醇紅細(xì)胞形態(tài)、穩(wěn)定性、滲透脆性均較包載前無明顯變化，載藥紅細(xì)胞48 h藥物釋放率為81%。

3.4 5-雜氮-2′-脫氧胞苷（5-Aza-2-dC）

Cinti等[25]運(yùn)用紅細(xì)胞成功包載了5-Aza-2-dC，基于紅細(xì)胞載體的高效和靶向基礎(chǔ)上用病毒刺突融合糖蛋白修飾，并通過熒光染色觀察其作用于人子宮頸癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)12 h后載藥紅細(xì)胞膜開始與Hela細(xì)胞膜黏附，藥物釋放入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，96 h后大部分Hela細(xì)胞開始凋亡。該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了用HA病毒蛋白修飾的載體紅細(xì)胞能通過與Hela細(xì)胞的高效黏附增強(qiáng)藥物的生物利用度。

其他被紅細(xì)胞包載的抗腫瘤藥物還有：依托泊苷、阿霉素、道諾霉素、柔紅霉素、多柔比星等。

4 小結(jié)

自載體紅細(xì)胞研究至今，其良好的生物相容性、生物可降解性、長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間等優(yōu)勢(shì)早已被人熟知，并且隨著對(duì)這些優(yōu)勢(shì)和抗腫瘤藥物研究的不斷深入，目前已包載了50多種物質(zhì)用于臨床研究和應(yīng)用。在載體紅細(xì)胞抗腫瘤研究中，人們通過對(duì)其進(jìn)行修飾，比如戊二醛修飾、磁化、變性處理等，提高載體紅細(xì)胞在抗腫瘤方面的器官靶向性，同時(shí)增加載體紅細(xì)胞的緩釋作用，這些處理方法均提高了藥物的抗腫瘤作用。雖然載體紅細(xì)胞的研究有很多重大突破，但是目前除了載L-門冬酰胺酶紅細(xì)胞已應(yīng)用于臨床治療急性淋巴細(xì)胞白血病外，大部分載體紅細(xì)胞包載藥物的研究均因藥物控釋不佳等停留在臨床前階段，并沒有真正地應(yīng)用于臨床，這也是此研究留下的一點(diǎn)遺憾。因此對(duì)載體紅細(xì)胞載藥的研究應(yīng)著重向臨床應(yīng)用推廣，這才是醫(yī)學(xué)研究者以后為之努力的方向。

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江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目（2011-WS-005）；2011年度南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（QYK 11167）#

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（2015-02-15）