王 琦 吳詩哲 齊旻悅

1（中山大學(xué) 中山醫(yī)學(xué)院，廣州510080）

2（中山大學(xué) 生命科學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣州510275）

阿斯巴甜（Aspartame），學(xué)名天門冬酰苯丙胺酸甲酯，俗稱甜味素，目前作為甜味劑和增味劑已在多個國家的食品工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。近年來，隨著食品安全問題日益得到重視，阿斯巴甜的生物安全問題再次引起了相關(guān)科研機構(gòu)的關(guān)注［1］。因此，有必要利用電生理技術(shù)進行更進一步的細胞水平研究，通過分析不同劑量阿斯巴甜對神經(jīng)元的自發(fā)放電、微小興奮性突觸后電流等生物電活動的影響，從而為進一步評估阿斯巴甜的生物安全性提供依據(jù)。

果蠅的嗅神經(jīng)環(huán)路是果蠅研究最深入的系統(tǒng)之一，其解剖結(jié)構(gòu)也已被詳細描述［2，3］，嗅神經(jīng)環(huán)路可以調(diào)控其很多高級的行為，如求偶、覓食、學(xué)習(xí)記憶等，同時在解剖學(xué)和形態(tài)與功能方面，具有高度的保守性［4］。從果蠅的嗅神經(jīng)環(huán)路入手，探究物質(zhì)的神經(jīng)毒性以及評估物質(zhì)對果蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是一種重要的實驗手段［5］。

膜片鉗技術(shù)是由德國生理學(xué)家Neher和Sakmann建立的一種以記錄通過離子通道的離子電流反映離子通道活動的技術(shù)［6，7］，是離子通道研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可直接為分子水平的生物膜離子通道特性，如門控動力學(xué)特征、藥理學(xué)特征、膜的通透性和選擇性等提供實驗證據(jù)。在具體的實驗過程中，利用負反饋電子線路設(shè)計，可將已破膜的目標(biāo)細胞（通常直徑為數(shù)μm2）的膜電位鉗制在一定水平，從而觀察和測定流過膜通道的離子電流。1980年后，隨著該技術(shù)的日臻完善，其在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸流行，大大促進了神經(jīng)藥理、神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)研究和形態(tài)學(xué)以及神經(jīng)系統(tǒng)電生理特性等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。應(yīng)用膜片鉗記錄在通道電流，可研究不同時間、不同部位、細胞膜內(nèi)外等條件下不同濃度的單體物質(zhì)對通道功能的影響。這對深入了物質(zhì)理學(xué)特性，藥物的生物安全性評估，以及對人和動物的生理功能影響，提供了分子水平的實驗證據(jù)。在膜片鉗的實驗結(jié)果基礎(chǔ)上可進一步研究相關(guān)通道蛋白質(zhì)亞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

1 實驗材料

1．1 果蠅品系與飼育

黑腹果蠅Drosophila melanogaster采用野生型Canton-S（CS），飼養(yǎng)環(huán)境為人工氣候箱，溫度為25±0．5℃，相對濕度為60±5%，光照周期為晝夜各12h循環(huán)光照；使用常規(guī)果蠅培養(yǎng)基飼育。配方如下：

表1 果蠅飼育培養(yǎng)基配方

制作步驟：（以800ml量為例）蔗糖52g，玉米粉68g，瓊脂6g，雙蒸水800ml，攪拌均勻；上述混合液放入電飯鍋煮沸，間斷開蓋攪拌均勻，以防玉米粉沉淀結(jié)塊；煮沸兩次后加酵母粉5．6g攪拌均勻；再次沸騰后加丙酸4ml攪拌均勻；分裝入培養(yǎng)瓶并塞緊海綿塞，防止外來果蠅飛入產(chǎn)卵，造成果蠅品系污染。

1．2 設(shè)備與耗材

果蠅培養(yǎng)人工氣候箱：上海一恒牌 MGC-450HPY-2；激光共聚焦顯微鏡：德國Zeiss LSM710；膜片鉗實驗平臺顯微鏡：日本Olympus BX51WI；解剖顯微鏡：德國Zeiss公司；放大器：美國Axon公司 Multiclamp 700B；數(shù)模轉(zhuǎn)換器：美國Axon公司Digidata 1440A；顯微操縱儀：美國Sutter MP225；浴槽：RC-26chamber；石英電極：美國Sutter公司。

1．3 實驗試劑

1）果蠅全腦解剖用酶液：木瓜蛋白酶；激動劑為L-半胱氨酸（L-cysteine）；蛋白酶凍存液配制：將純度為≥99%的木瓜蛋白酶冰上分裝為5μL／支，凍存于-20℃。

2）單細胞記錄用細胞外液：

表2 單細胞記錄用細胞外液母液配比（5L，pH＝7．2，Osm＝250）

上述母液存放于4℃保存，每次實驗前配置細胞外液，方法如下（以100ml細胞外液為例）：80ml超純水＋10ml Stock A＋10ml Stock B＋20μl Stock C，得到100ml實驗用細胞外液。

3）果蠅細胞內(nèi)液：

表3 單細胞自發(fā)放電記錄用細胞內(nèi)液配比（100ml，pH＝7．2，Osm＝235）

4）Confocal成像用液體：4%formadldehyde，0．01MPBS（pH7．4），Tris-PBS（含0．2%Tris-ton），PBST（含5%BSA），購于廣州化學(xué)試劑廠；鼠源nc 82抗體，羊抗鼠 Alexa Fluor 488 抗體，Rhodamine-adidin染料，阿斯巴甜單體；購于Sigma試劑公司；

2 實驗方法

2．1 實驗前準(zhǔn)備

將制備好的新鮮細胞外液通入氧氣（95%O2＋5%CO2）至氧飽和；預(yù)熱電極拉制儀30min，并拉制電極使，確認膜片鉗的刺激／記錄電極表面鍍有一層均勻的Agcl；，解凍提前分裝并凍存的細胞內(nèi)液一支；，制備蛋白酶激動液：用上述氧飽和的細胞外液加入L-半胱氨酸制備濃度為1μmol／L的激動液，充分混勻后靜置備用；，配制解剖果蠅全腦用蛋白水解酶：解凍后加細胞外液稀釋至70倍，按照體積比酶液∶激動液＝8∶1的比例制備解剖用蛋白水解酶，充分混勻后靜置備用。

2．2 果蠅全腦急性解剖

黑腹果蠅的三齡幼蟲個體較大，腦組織最大，蟲體包裹在透明的硬膜內(nèi)，易于神經(jīng)組織的定位和解剖，因此是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)時常用的實驗材料。本章實驗果蠅全腦來自孵化前兩天的三期幼蟲。解剖體系使用當(dāng)日配制并氧飽和的細胞外液。利用一次性注射器將三七幼蟲的頭部取下，剝?nèi)ビ材ひ约暗诙幽ず蠼肱渲坪玫哪竟系鞍酌该敢?。靜置3 min，剝離果蠅腦外殼，此時可見全腦神經(jīng)組織包裹在氣囊硬膜下。靜置待酶液消化周圍結(jié)締組織鞘，輕輕剝離氣囊，得到膜片鉗記錄用果蠅全腦腦片。利用細胞外液洗滌腦組織三次，移入記錄浴槽并注入2ml細胞外液。利用特制的鉑金絲hoder固定浴槽內(nèi)的果蠅腦片，使待記錄的功能區(qū)域暴露。此時可移入膜片鉗操作臺進行記錄。在電生理記錄過程中全程采用連續(xù)流動的含氧細胞外液灌流貫，并且保持浴槽液面平穩(wěn)［8，9］。

2．3 電生理記錄

使用HEKA Patchmaster記錄軟件。目標(biāo)細胞形成GΩ級高阻封接，給與短暫負壓破膜，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，將細胞鉗制在-70mV電位進行記錄。選取細胞狀態(tài)良好的數(shù)據(jù)。待電壓鉗電信號穩(wěn)定后，加入TTX和PTX阻斷鈉離子通道產(chǎn)生的自發(fā)性和動作性電流以及GABA通道產(chǎn)生的抑制性電流，加入阻斷劑3min以后讀取數(shù)據(jù)，此時記錄mEPSC。加入不同濃度阿斯巴甜溶液，3min后記錄給藥后mEPSC。

2．5 目標(biāo)神經(jīng)元的confocal成像

果蠅的PNs神經(jīng)元confocal成像采用注射染料法：實驗前將0．4%生物素（biocytin）加入果蠅內(nèi)液。急性分離出果蠅全腦后在60倍水鏡下找到果蠅的觸角葉（Antennal Lobe，AL），位于 AL上層的神經(jīng)元為PNs。把含有0．4%biocytin的內(nèi)液充盈至微電極約1／3，輕彈電極中部，待尖端氣泡完全排除后安裝在電極夾持器上。用顯微操縱器使電極尖端進入浴槽中細胞外液液面以下，給與適當(dāng)正壓并補償液接電位。本章實驗用微電極充盈細胞內(nèi)液后尖端如水電阻在10～15MΩ范圍。選取視野內(nèi)細胞狀態(tài)良好的作為目標(biāo)細胞，通常要求胞體折光度好、胞體較規(guī)則、表面光滑有立體感的細胞，細胞周圍無明顯雜質(zhì)。調(diào)節(jié)微電極至目標(biāo)細胞附近，靠近并給予負壓，此時微電極與目標(biāo)細胞膜形成GΩ級的高封接電阻。持續(xù)2min以上，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定，給予適當(dāng)短暫負壓，此時細胞破膜，若漏電流絕對值低于-50pA，且靜息電位低于-40mV，認為細胞破膜成功且狀態(tài)良好。維持該狀態(tài)40min以上，使電極內(nèi)液中的生物素充分?jǐn)U散到目標(biāo)細胞胞體，輕輕撤去電極，所得果蠅腦樣本用于confocal成像實驗。

果蠅腦樣品置于200ml的4%福爾馬林溶液中于4℃過夜固定（固定時長3h以上即可，過夜固定效果較好）。配制0．01MPBS溶液（pH＝7．2±0．1）。利用該溶液將固定后的果蠅腦樣品洗滌3次。漂洗后的樣品置于200ml含0．2%Triton的PBST透明20min～30min。置于200ml含5%BSA的PBST終止反應(yīng)。然后按照體積比10∶1加入鼠源抗體nc 82，該體系置于4℃孵育24h。孵育后的樣品用PBS溶液重復(fù)洗滌，每次洗滌三次，中間間隔20min。按照體積比加入200∶1的羊抗鼠Alexa Fluor 488抗體、500∶1rhodamine-avidin染料、200∶1streptavidin-CY3抗體，靜置于4℃孵育24h。按照上述重復(fù)洗滌的方法用PBS洗滌樣本后制片、封片。于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察并拍照。所得數(shù)據(jù)在Imaris 6．4．2軟件中進行3D重建并輸出。

2．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用mini analysis數(shù)據(jù)分析軟件進行分析：使用Fitmaster打開原始數(shù)據(jù)文件；將文件轉(zhuǎn)換成ABF格式；用mini analysis軟件讀取轉(zhuǎn)換后的文件，進行mEPSC分析。數(shù)據(jù)選取條件為：幅值小于20mV、rising time小于10ms、rising time大于decay time。被選取的信號被mini60計入統(tǒng)計并分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，組間差異統(tǒng)計使用獨立樣本t檢驗。分析軟件使用clampfit 10．0。圖形和數(shù)據(jù)分析使用SPSS 11．0。數(shù)據(jù)輸出和圖像繪制使用 Origin 8．0、Microsoft Visio 2007。

3 實驗結(jié)果

3．1 PNs神經(jīng)元在果蠅全腦的激光共聚焦成像

圖1為果蠅腦單個PN神經(jīng)元的激光共聚焦實驗結(jié)果。本實驗所選擇PNs神經(jīng)元主要位于果蠅觸角葉垂直上方，胞體直徑約為10～20μm。該結(jié)果顯示了果蠅PNs胞體位于Antenna Lobe，其投射可到達蘑菇體和外側(cè)角。

圖1 蠅PNs神經(jīng)元的形態(tài)和位置

3．2 不同濃度阿斯巴甜對PNs神經(jīng)元mEPSCs的影響

圖2 加入不同濃度阿斯巴甜后果蠅PNs神經(jīng)元mEPSCs的記錄

圖3 不同濃度阿斯巴甜對果蠅PNs神經(jīng)元mEPSCs的影響

本實驗采用全細胞膜片鉗記錄方法，將外液灌流時加入TTX和PTX以阻斷GABA受體，實驗結(jié)果表明，給藥3min后mEPSCs的幅值有如下不同：高濃度組 mEPSCs的幅值為（2．75±0．2）pA，與給藥前（2．63±0．3）pA 相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05；n＝12）；低濃度組 mEPSCs的幅值為（2．68±0．2）pA，與給藥前（2．66±0．2）pA相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05；n＝12）；給藥3min后 mEPSCs的頻率有如下不同：高濃度組mEPSCs的頻率為（0．21±0．03）Hz，與給藥前（0．48±0．05）Hz相比頻率明顯降低且具有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01；n＝12）；低濃度組 mEPSCs的頻率為（0．36±0．02）Hz，與給藥前（0．45±0．03）Hz相比差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05；n＝12）（見圖2、圖3）。實驗發(fā)現(xiàn)，高濃度的阿斯巴甜非常顯著降低果蠅PNs的mEPSCs頻率，而低濃度組降低效果較弱，但依舊具有統(tǒng)計學(xué)差異。兩個濃度均對mEPSCs的幅值沒有影響。

3．3 不同濃度阿斯巴甜對PNs神經(jīng)元sAP的影響

圖4 加入不同濃度阿斯巴甜后果蠅PNs神經(jīng)元sAP的記錄

圖5 不同濃度阿斯巴甜對果蠅PNs神經(jīng)元sAP的影響

本實驗采用全細胞膜片鉗記錄方法，記錄給予不同濃度阿斯巴甜后果蠅投射神經(jīng)元膽堿能突觸電流鉗模式下自發(fā)電活動，實驗結(jié)果表明，給藥3min后sAP的幅值有如下不同：高濃度組sAP的幅值為（15．7±0．5）mV，與給藥前（10．8±0．4）mV 相比頻率明顯降低且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05；n＝12）；低濃度組sAP的幅值為（11．9±0．7）mV，與給藥前（11．3±0．6）mV相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05；n＝12）；給藥3min后sAP的頻率有如下不同：高濃度組sAP的頻率為（0．13±0．08）Hz，與給藥前（1．78±0．11）Hz相比頻率明顯降低且具有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01；n＝12）；低濃度組sAP的頻率為（1．59±0．07）Hz，與給藥前（1．79±0．13）Hz相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05；n＝12）（見圖4、圖5）。實驗發(fā)現(xiàn)，給予急性分離的果蠅腦組織高濃度的阿斯巴甜后可以顯著增加果蠅PNs的sAP幅值，同時非常顯著降低sAP頻率，而低濃度組在上述實驗中均未表現(xiàn)出具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。

4 討論

阿斯巴甜是食品工業(yè)廣泛使用的人造甜味劑，有生化代謝研究表明其在人體內(nèi)的腸道酯酶和肽酶的作用下可產(chǎn)生3種主要代謝產(chǎn)物：天門冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇。雖然阿斯巴甜的安全性通過了多個國家相關(guān)食品安全部門的檢驗，但是越來越多的研究證據(jù)使得人們對它的安全性提出質(zhì)疑。有歐洲的科研機構(gòu)發(fā)現(xiàn)在給與大鼠一定量阿斯巴甜的條件下有引起實驗動物多臟器腫瘤的風(fēng)險，包括白血病、神經(jīng)鞘瘤和淋巴細胞瘤。部分神經(jīng)毒理學(xué)研究顯示，高劑量的阿斯巴甜（＞1000mg／kg）可以改變實驗大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的水平［10，11］，其原因可能是阿斯巴甜的代謝產(chǎn)物之一苯丙氨酸與其他中性氨基酸競爭性通過血-腦屏障，并因此改變大腦血液中苯丙氨酸與中性氨基酸的比值，增加腦內(nèi)苯丙氨酸的水平，最終干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞［12］。此外，還有報道顯示阿斯巴甜會引起偏頭痛、老年癡呆癥［13］等，因此在突觸水平研究阿斯巴甜對離子通道的影響對于揭示其生物安全性有重要意義。

果蠅有四對染色體，包含人類基因80%的同源基因，而且這些同源基因的功能相似［14］。雖然果蠅的中樞神經(jīng)系統(tǒng)簡單卻調(diào)控著如學(xué)習(xí)記憶、求偶、睡眠、抉擇等一系列復(fù)雜的行為活動。在進化方面，果蠅的基因具有較高的保守性，因此利用果蠅為研究材料制造疾病模型已廣泛應(yīng)用在當(dāng)前的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中，以果蠅為模型研究神經(jīng)系統(tǒng)的一些基本問題，是一個簡捷而有效的途徑［15-17］。本研究所用果蠅全腦組織由急性分離制得，基本保留了完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)包括膽堿能通路，符合實驗需要。在果蠅腦的中央?yún)^(qū)，位于觸角葉的投射神經(jīng)元，即PNs約為200個，是嗅覺信息處理的二級神經(jīng)元，可接收來自嗅覺神經(jīng)元和中間神經(jīng)元傳遞的信息。PNs既是膽堿神經(jīng)元又是膽堿受體神經(jīng)元，可接受來自嗅覺受體神經(jīng)元的膽堿能突觸傳入信息和潛在的側(cè)枝興奮性輸入，其軸突可進一步將投射到蘑菇體和外側(cè)角，將信息整合并傳達至果蠅的第三級嗅覺中樞。有研究者通過對果蠅PNs電活動的探究從而探討神經(jīng)藥理學(xué)機制［18］。

突觸的活動是神經(jīng)系統(tǒng)實現(xiàn)其功能的重要基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對于突觸后電流的研究，有助于進一步探討不同神經(jīng)元之間網(wǎng)絡(luò)信號傳遞的發(fā)生，進一步揭示相關(guān)的生物學(xué)機制。突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)，其中信號傳遞過程受到囊泡釋放、突觸后神經(jīng)元響應(yīng)等環(huán)節(jié)調(diào)控。全細胞記錄的神經(jīng)元電活動，在時間和空間上具有總和性。自發(fā)性電活動反映的是細胞膜所有離子通道電活動特性的總和，本實驗中高濃度的阿斯巴甜對于sAP的幅值和頻率均有顯著影響，說明該人造甜味劑對果蠅中樞神經(jīng)元細胞膜離子通道活動有一定的影響。昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，主要興奮性遞質(zhì)系統(tǒng)是膽堿能的，本研究所涉及的果蠅嗅神經(jīng)環(huán)路屬膽堿能系統(tǒng)，是果蠅學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)環(huán)路重要的組成部分，因此研究給藥前后微小興奮性突觸后電流變化對探明藥物作用機制和突觸可塑性影響有重要作用。實驗中，mEPSCs頻率的變化說明了不同濃度阿斯巴甜對果蠅PNs的突觸前膜釋放乙酰膽堿的數(shù)量有影響，且高濃度的影響更為顯著。因此，阿斯巴甜可通過調(diào)控果蠅神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能輸入環(huán)路從而產(chǎn)生一定的生物學(xué)影響?？紤]到mEPSCs與突觸可塑性具有緊密聯(lián)系，因此可推斷阿斯巴甜可能對突觸可塑性具有潛在的影響，該影響可能是這種人造甜味劑引起偏頭疼和老年癡呆癥的生物學(xué)機制之一。mEPSCs反映了突觸前膜和突觸后膜的調(diào)控，涉及囊泡釋放與受體結(jié)合等多個生物化學(xué)過程，因此阿斯巴甜對神經(jīng)中樞的影響可從相關(guān)離子通道的角度進一步深入探究［19，20］。

果蠅的嗅神經(jīng)環(huán)路與其多個復(fù)雜的高級神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的行為密切相關(guān)。此外果蠅是研究脊椎動物的優(yōu)良模式生物，它的嗅覺反映生理學(xué)和行為學(xué)的相關(guān)研究近年來是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要課題［21］，許多毒理學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)現(xiàn)均以此為研究基礎(chǔ)。本研究以觸角葉為切入點，探討人造甜味劑阿斯巴甜對果蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，從而對評估其生物安全性提供可靠的參考。

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