孫麗，朱世平，夏日煒，黃小國，吳圣龍，包文斌*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2.常州康樂農(nóng)牧有限公司，江蘇常州213149）

MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變對(duì)基因表達(dá)和經(jīng)濟(jì)性狀的影響

孫麗1，朱世平1，夏日煒1，黃小國2，吳圣龍1，包文斌1*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2.常州康樂農(nóng)牧有限公司，江蘇常州213149）

研究報(bào)道MUC13基因第2內(nèi)含子的插入/缺失突變與ETEC F4導(dǎo)致的仔豬腹瀉病密切相關(guān)，但該突變位點(diǎn)是否會(huì)對(duì)基因表達(dá)和經(jīng)濟(jì)性狀（如一般抗病力、生產(chǎn)性狀及繁殖性能等）造成影響還有待評(píng)估。本試驗(yàn)通過PCR方法檢測(cè)大白豬群體中該突變位點(diǎn)的多態(tài)性，并分析其對(duì)大白豬MUC13基因mRNA表達(dá)水平、部分重要細(xì)胞因子水平（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TGF-β及TNF-α）、生產(chǎn)性狀及繁殖性能的影響，以探究將該位點(diǎn)作為抗性遺傳標(biāo)記應(yīng)用于抗病育種實(shí)踐的可行性。結(jié)果表明：該位點(diǎn)在大白豬群體中存在3種基因型；不同基因型個(gè)體間組織mRNA表達(dá)水平、重要細(xì)胞因子水平、生產(chǎn)性狀及1～4胎繁殖性能（總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬數(shù)）差異均不顯著（P＞0.05）。綜上所述，將MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變作為大白豬抗性遺傳標(biāo)記進(jìn)行分子選育時(shí)，不會(huì)對(duì)機(jī)體基因表達(dá)和重要經(jīng)濟(jì)性狀造成顯著影響。本研究為將該突變位點(diǎn)作為大白豬抗仔豬腹瀉分子選育遺傳標(biāo)記的可靠性提供了一定的理論依據(jù)。

MUC13基因；大白豬；ETEC F4；遺傳標(biāo)記

仔豬腹瀉是規(guī)?；i場(chǎng)最常見的一類疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)因腹瀉死亡的仔豬占仔豬死亡總數(shù)的39.8%［1］,給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的預(yù)防性措施(如抗生素的使用)并沒有從根本上消除仔豬腹瀉病的發(fā)生與流行,而從遺傳角度提高豬的抗病性具有治本的功效。因此,了解仔豬細(xì)菌性腹瀉的遺傳學(xué)機(jī)理并獲得有效的抗性遺傳標(biāo)記對(duì)預(yù)防和控制疾病的發(fā)生具有深遠(yuǎn)意義。研究表明,產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F4是初生和斷奶仔豬腹瀉和死亡的主要病原菌,包含F(xiàn)4ab、F4ac和F4ad 3種亞型,其中F4ac是主要的致病菌［2］。ETEC F4通過其菌毛等粘附素與相應(yīng)受體結(jié)合,從而抵制腸道蠕動(dòng)和腸液的沖洗作用,并分泌大量的腸毒素刺激上皮細(xì)胞分泌大量液體進(jìn)入腸腔,最終導(dǎo)致腹瀉等疾病。因此,ETEC F4致病的關(guān)鍵在于仔豬小腸茹膜上皮細(xì)胞刷狀緣能否表達(dá)相應(yīng)受體,不表達(dá)受體的仔豬對(duì)ETEC F4具有抗性。

Zhang等［3］研究表明,MUC13基因與ETEC F4ab/ac受體位點(diǎn)存在連鎖不平衡現(xiàn)象,為豬ETEC F4ab/ac病的抗性分子標(biāo)記選擇提供一定依據(jù)。Ren等［4］通過全基因組連鎖定位分析、目的區(qū)域的斷點(diǎn)重組分析和遠(yuǎn)緣群體的高通量SNPs標(biāo)記關(guān)聯(lián)性分析等遺傳研究手段,最終確定了MUC13為決定斷乳仔豬腹瀉抗性或易感性的ETEC F4ac受體基因。楊懷谷［5］則進(jìn)一步將MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變作為仔豬ETEC F4抗性潛在的重要遺傳標(biāo)記。本文系統(tǒng)分析了MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變對(duì)大白豬試驗(yàn)群體MUC13基因mRNA表達(dá)水平、部分重要細(xì)胞因子水平、生產(chǎn)性狀及繁殖性能的影響,以探究將該突變位點(diǎn)作為ETEC F4抗性遺傳標(biāo)記應(yīng)用于大白豬抗病育種的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料138頭大白豬來自常州康樂農(nóng)牧有限公司(國家生豬核心育種場(chǎng)),每個(gè)個(gè)體采耳組織塊約1.0 g,放入1.5 mL的EP管內(nèi)于冰盒中取回實(shí)驗(yàn)室采用常規(guī)酚-氯仿法提取耳樣DNA,用于檢測(cè)MUC13基因第2內(nèi)含子多態(tài)性。檢測(cè)基因型后選取不同基因型35日齡個(gè)體共80頭用于測(cè)定部分重要細(xì)胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TGF-β及TNF-α)水平,并對(duì)其中14頭仔豬進(jìn)行屠宰取樣。屠宰所取組織樣包括心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、肌肉、胸腺、淋巴結(jié)、十二指腸和空腸11個(gè)組織,現(xiàn)場(chǎng)液氮保存,然后轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 多態(tài)性分析PCR引物參照文獻(xiàn)［6］,同時(shí)利用MUC13基因的mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001105293.1)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物(如表1),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為模板DNA(100 ng/μL),PCR Master-Mix(北京天根生化科技有限公司)10.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體系至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min, 95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30次循環(huán),然后72℃延伸10 min,最后4℃保存。基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接用12%聚丙烯酸胺凝膠電泳銀染分析判型。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.3 總RNA的提取及RT-PCR反應(yīng)按照試劑盒的要求,利用Trizol法提取仔豬各個(gè)組織總RNA,以2.2%甲醛變性凝膠電泳和NanoDrop-1000微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的純度和濃度,-70℃保存待用。

cDNA合成反應(yīng)體系(10 μL)：5×PrimerScript Buffer反應(yīng)液2μL,Primer ScriptRT Enzyme Mix I 0.5 μL, Oligo dT 0.5 μL,Random 6 mers 0.5 μL,總RNA 500 ng, RNase free H2O補(bǔ)足至10 μL；反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃5 s,最后4℃保存。

RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L),SYBR Green Real-time PCR Master Mix(2×)10 μL,ROX Reference Dye II (50×)0.4 μL,雙蒸水7.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃, 30 s；95℃,5 s,60℃,34 s,經(jīng)40個(gè)循環(huán)后4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線,用以判斷PCR擴(kuò)增的單一性。每份樣本進(jìn)行3次重復(fù),取平均值。

1.4 免疫指標(biāo)測(cè)定斷奶后35日齡前腔靜脈采血5 mL,于4℃傾斜靜置30 min,待血清析出后1 000 r/min離心10 min,制得血清樣品置于-70℃保存?zhèn)溆?。利用ProCarta免疫分析試劑盒對(duì)8個(gè)細(xì)胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TGF-β、TNF-α)水平含量進(jìn)行測(cè)定。

1.5 部分經(jīng)濟(jì)性狀的測(cè)定［7］在185～195日齡,B超活體測(cè)定大白豬的眼肌厚、背膘厚,稱量體重,并詳細(xì)記錄1～4胎次的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)及斷奶仔豬數(shù)。“100 kg體重日齡和100 kg背膘厚”,校正公式如下：校正日齡=測(cè)定時(shí)日齡-(實(shí)測(cè)體重-100)/CF1, CF1=(實(shí)測(cè)體重/測(cè)定日齡)×1.715(母豬)；校正背膘厚=實(shí)測(cè)背膘厚×CF2,其中CF2=A/{A+[B×(實(shí)測(cè)體重-100)]}。大白母豬的A值和B值分別為13.706和0.119。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律計(jì)算基因型及等位基因頻率,p=P+H/2,q=Q+H/2,χ2=∑d2/e。其中d=e-o是期望值與觀測(cè)值之差,p、q分別表示給定位點(diǎn)上的等位基因的頻率；相對(duì)定量的結(jié)果采用2-??Ct法進(jìn)行處理,2-??Ct法計(jì)算公式：??CT=(待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組看家基因平均Ct值)-(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組看家基因平均Ct值),即每一個(gè)組織目標(biāo)基因表達(dá)經(jīng)內(nèi)參均一化處理后相對(duì)于某個(gè)組織的倍數(shù),用內(nèi)參基因GAPDH對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行均一化,計(jì)算個(gè)體各個(gè)組織的表達(dá)量；利用SPSS16.0軟件的廣義線性模型(General Linear Model,GLM)對(duì)基因型與mRNA表達(dá)水平、重要細(xì)胞因子水平、生產(chǎn)性狀及繁殖性能的關(guān)系進(jìn)行最小二乘法分析,統(tǒng)計(jì)模型為Yijk=μ+Gi+Fj+eijk,其中Yijk為性狀觀察值；μ為群體平均值；Gi為第i種基因型的固定效應(yīng)；Fj為第j個(gè)家系的固定效應(yīng)；eijk為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物直接電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酸胺凝膠電泳分析后產(chǎn)生3種帶型,擴(kuò)增產(chǎn)物為151 bp的條帶定義為AA型,同時(shí)具有151 bp和83 bp的條帶為AB型,只有83 bp的擴(kuò)增條帶為BB型(圖1)。

圖1 豬MUC13基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子基因型及等位基因頻率分析利用PCR產(chǎn)物直接電泳的方法對(duì)138頭大白豬個(gè)體進(jìn)行檢測(cè),分型后計(jì)算出基因型和等位基因頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大白豬群體被檢測(cè)到2種等位基因,共3種基因型,其中B為優(yōu)勢(shì)等位基因。χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明,大白豬群體在MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)(表2)。

表2 大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子基因型及等位基因頻率

2.3 MUC13基因在不同基因型大白豬中的mRNA組織表達(dá)差異內(nèi)參基因GAPDH對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行均一化,并以心臟組織的相對(duì)表達(dá)量為1,以對(duì)MUC13基因在不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果顯示,3種基因型個(gè)體對(duì)應(yīng)的各組織MUC13基因的表達(dá)量間差異均不顯著(P＞0.05)；MUC13基因在腸道組織(十二指腸和空腸)中的表達(dá)量較高(表3)。

2.4 大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變與細(xì)胞因子的關(guān)聯(lián)分析80頭大白豬來自4個(gè)家系,但經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)不同家系之間的細(xì)胞因子水平差異不顯著(P＞0.05),因此試驗(yàn)群體未分家系進(jìn)行分析。相關(guān)性分析結(jié)果表明,試驗(yàn)群體3種基因型個(gè)體間的細(xì)胞因子水平差異不顯著(P＞0.05)(表4)。

表3 MUC13基因在不同基因型大白豬中的mRNA組織表達(dá)差異

表4 大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變與細(xì)胞因子水平的關(guān)聯(lián)分析pg·μL-1

2.5 大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變與生產(chǎn)性狀及繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析相關(guān)性分析結(jié)果表明,3種基因型對(duì)應(yīng)的生產(chǎn)性狀,1～4胎次的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬數(shù)間差異均不顯著(P＞0.05)(表5和表6)。

3 討論

MUC13基因存在MUC13-A和MUC13-B 2種拷貝類型,且兩者是等位基因關(guān)系［5］。測(cè)序發(fā)現(xiàn)MUC13存在14個(gè)大于2 bp的插入/缺失突變位點(diǎn),其中最大的插入/缺失位點(diǎn)為68 bp［6］。本研究采用直接PCR的方法對(duì)最大插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),獲得大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變3種基因型為AA、AB和BB,其中B為優(yōu)勢(shì)等位基因。χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明,大白豬群體在MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)。

MUC基因表達(dá)產(chǎn)物粘蛋白(mucins)又稱上皮粘蛋白,是組織上皮細(xì)胞產(chǎn)生的,由膜結(jié)合和分泌型糖蛋白所組成的大分子蛋白家族。它在潤滑、保護(hù)表皮細(xì)胞以及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要的作用［8］。MUC13蛋白作為粘蛋白家族的一員,在正常情況下,主要表達(dá)于各種分泌腺的上皮細(xì)胞,并對(duì)上皮細(xì)胞起保護(hù)和潤滑作用；同時(shí)粘蛋白還通過其特殊的結(jié)構(gòu)向細(xì)胞內(nèi)傳達(dá)信息,參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其位置分布的特殊性使其成為茹膜防御體系的第一道屏障,保護(hù)茹膜抵御外來物質(zhì)及微生物的侵犯［9］。本研究發(fā)現(xiàn)3種基因型個(gè)體對(duì)應(yīng)的MUC13基因的表達(dá)豐度差異均不顯著,提示MUC13基因第2內(nèi)含子的插入/缺失突變不會(huì)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生顯著影響；此外,不同基因型個(gè)體的MUC13基因在腸道組織(十二指腸和空腸)中的表達(dá)量均較高,與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致［3,10］,說明MUC13在抵抗腸道微生物感染中發(fā)揮著重要作用,但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究分析。

Ren等［10］研究發(fā)現(xiàn),MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變位點(diǎn)MUC13-A拷貝類型純合時(shí),豬只均表現(xiàn)為ETEC F4ac抗性,即AA基因型個(gè)體對(duì)ETEC F4有特殊抗性。在抗病育種實(shí)踐中,人們希望培育出的抗性群體在能夠抵抗疾病感染的同時(shí),其他各種生產(chǎn)性能還能夠保持穩(wěn)定或有所提高。因此,基于重要候選基因及其遺傳標(biāo)記開展分子選育提高群體特殊特性的同時(shí),尤其需要關(guān)注所開展的標(biāo)記輔助選擇對(duì)群體的一般抗病力和生產(chǎn)繁殖等重要經(jīng)濟(jì)性狀的影響。而目前關(guān)于大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變與這些重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系研究尚未見相關(guān)報(bào)道。衡量動(dòng)物機(jī)體對(duì)疾病抵抗能力大小的指標(biāo)有很多,其中細(xì)胞因子是機(jī)體免疫細(xì)胞分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子多肽,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、促進(jìn)造血、參與炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌效應(yīng)等多種生物學(xué)功能［11］；免疫指標(biāo)可代表機(jī)體的免疫功能狀態(tài),從而間接反映機(jī)體的抗病能力［12］,因此可通過免疫指標(biāo)的測(cè)定來了解動(dòng)物的一般抗病力。本試驗(yàn)中,大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變與細(xì)胞因子水平的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明, 3種基因型個(gè)體對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子水平間沒有顯著差異,提示針對(duì)大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變的分子選育不會(huì)對(duì)機(jī)體一般抗病力產(chǎn)生顯著的影響。

100 kg體重日齡、100 kg背膘厚和眼肌厚是育種實(shí)踐中對(duì)豬生長速度及瘦肉率的重要評(píng)價(jià)指標(biāo),繁殖性能也是決定養(yǎng)豬生產(chǎn)效益的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo),本研究結(jié)果表明,3種基因型個(gè)體間的100 kg體重日齡、100 kg背膘厚、眼肌厚、1～4胎的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬數(shù)差異均不顯著,說明針對(duì)大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變的分子選育不會(huì)對(duì)這2種重要經(jīng)濟(jì)性狀產(chǎn)生不利的影響。

表5 大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

表6 大白豬MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

4 結(jié)論

MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變?cè)诖蟀棕i群體中共檢測(cè)到2種等位基因,3種基因型,其中B為優(yōu)勢(shì)等位基因；3種基因型個(gè)體對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)水平、重要細(xì)胞因子水平、生產(chǎn)性狀以及1～4胎的繁殖性能間均無顯著差異,將MUC13基因第2內(nèi)含子插入/缺失突變作為大白豬抗性遺傳標(biāo)記進(jìn)行分子選育時(shí),不會(huì)對(duì)機(jī)體基因表達(dá)和重要經(jīng)濟(jì)性狀造成顯著影響。

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Effect of Insertion/Deletion Mutation in MUC13 Gene Intron 2 on Gene Expression Level and Economic Traits

SUN Li1,ZHU Shi-ping1,XIA Ri-wei1,HUANG Xiao-guo2,WU Sheng-long1,BAO Wen-bin1*
（1.Key Laboratory for Animal Genetics,Breeding,Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province, College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Jiangsu Yangzhou 225009,China；2.Changzhou Kangle Farming Co.,Ltd.,Jiangsu Changzhou 213149,China）

It is reported that the insertion/deletion mutation in intron 2 of MUC13 gene is closely related to piglet diarrhea which is induced by ETEC F4,while it is unclear whether the mutation affects the gene expression level and economic traits（e.g.general disease resistance ability,production traits and reproductive performance）or not.This study detected the polymorphism of this site via PCR method in Yorkshire groups,then analyzed the effects of polymorphism on MUC13 mRNA expression level,partial important cytokine levels（IL-1β,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10, IFN-γ,TGF-β and TNF-α）,production traits and reproductive performance.On this basis,the study assessed the feasibility of this mutation site as one resistance genetic marker to be applied in resistance breeding.The results indicated that three genotypes were identified in test groups,and the mRNA expression levels,cytokines levels, production traits and reproductive performances（total number born,number born alive and number of piglets weaned）from first to fourth parity all had no significant difference among three genotypes individuals（P＞0.05）.In conclusion, the insertion/deletion mutation in intron 2 of MUC13 gene had no significant effect on gene expression level and important economic traits when regarded it as an important anti-disease genetic marker for molecular breeding in Yorkshire.This study provided a theoretical basis for the reliability of regarding this mutation site as an anti-diarrhea molecular breeding genetic marker in Yorkshire.

MUC13 gene；Yorkshire；ETEC F4；genetic marker

S828.2

A

0258-7033（2015）09-0004-05

2014-06-25；

2014-12-06

江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2013319、BE2014328、BE2014310）；常州市科技支撐計(jì)劃（CE2013011）；揚(yáng)州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012038-17）

孫麗（1992-），女，江蘇如皋人，碩士生，專業(yè)方向?yàn)樨i抗病育種，E-mail：sl19920327@163.com

*通訊作者：包文斌（1974-），男，博士，研究員，研究方向?yàn)樨i遺傳育種，E-mail：wbbao@yzu.edu.cn