黃曉丹，李先學(xué)

(莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100)

伴隨著時(shí)代的飛速發(fā)展，納米科學(xué)技術(shù)成為了21 世紀(jì)信息時(shí)代的核心，納米顆粒的制備、應(yīng)用及其微觀層次上性能的研究吸引了廣大研究人員的不斷探索。金納米顆粒是一種新型的催化劑，在催化氧化反應(yīng)中具有很高的活性，同時(shí)金納米還具有很多特性，如具有介電特性、很高的電子密度和可以與各種生物分子結(jié)合且不會(huì)使生物體失去活性，正是由于這些特性讓金納米顆粒在各大領(lǐng)域都有很大的應(yīng)用價(jià)值［1］。

金納米顆粒的制備方法有化學(xué)法、物理法和生物法三大類。物理法對(duì)儀器設(shè)備要求較高，生產(chǎn)費(fèi)用昂貴，且對(duì)貴金屬納米材料形貌的調(diào)控能力有限［2-4］;化學(xué)制備方法條件簡單、成本低、產(chǎn)量大，所以，目前對(duì)于金納米顆粒的制備方法研究最多的是化學(xué)法，但給環(huán)境帶來了一定程度的污染［5-10］，顯然，不符合現(xiàn)在的可持續(xù)發(fā)展理念。近幾年來，材料制備過程綠色化的研究日趨活躍，生物法受到了越來越多的重視，其反應(yīng)過程中不用添加除金屬前驅(qū)體外的其他化學(xué)試劑，且反應(yīng)條件溫和［11］，因此，本文利用畢赤酵母干粉還原氯金酸制備金納米顆粒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖均為分析純;大豆蛋白胨，生化試劑。

SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器;SPX-150B-Z 生化培養(yǎng)箱;YX-280D 高壓滅菌鍋;SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái);SHZ-82 恒溫振動(dòng)器;BS124 電子天平;SIGMA3-18K 冷凍離心機(jī);Cary 5000 紫外可見近紅外分光光度計(jì);TAS-986 原子吸收分光光度計(jì);TECNAI F30場(chǎng)發(fā)射透射電鏡;X’Pert Pro X 射線粉末衍射儀;Nicolet IR200 傅里葉變換紅外光譜儀。

1.2 畢赤酵母干粉及金納米顆粒的制備

1.2.1 HAuCl4(48.56 mmol/L)溶液的配制 把1 g 氯金酸，置于50 mL 燒杯中，用20 mL 去離子水溶解，然后移入50 mL 容量瓶并定容至50 mL，即為48.56 mmol/L HAuCl4溶液。

1.2.2 畢赤酵母干粉的制備 大豆蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。在30 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的菌體在4 000 r/min條件下，離心20 min，除去上清液，菌體用去離子水洗滌3 次，將濕菌體置于80 ℃烘箱中干燥至恒重，冷卻后研磨成粉，用60 目篩過篩，過篩物即為畢赤酵母干粉(60 目)，存于干燥器中備用。

1.2.3 畢赤酵母干粉還原HAuCl4制備金納米顆粒 在100 mL 錐形瓶中，加入一定量的去離子水、一定量的HAuCl4(48.56 mmol/L)溶液，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH 值，再加入一定量的畢赤酵母干粉，置于恒溫培養(yǎng)搖床(轉(zhuǎn)速為150 r/min)中振搖混合，每隔一段時(shí)間取樣分析。

1.3 畢赤酵母干粉對(duì)［AuCl4］－吸附量的測(cè)定

畢赤酵母干粉對(duì)［AuCl4］－的吸附量Q(mg/g)計(jì)算式為:

式中 C0——HAuCl4溶液的初始濃度，mg/L;

Ce——溶液中殘余［AuCl4］－的濃度，mg/L;

Cb——畢赤酵母干粉的濃度，g/L。

1.4 金納米顆粒的表征

1.4.1 紫外-可見光譜(UV-Vis) 取1 mL 反應(yīng)液，稀釋一定倍數(shù)后，倒入1 cm ×1 cm 的比色皿中，以水為參比，在紫外可見近紅外分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)，掃描波長范圍為400 ～1 100 nm，掃描步長為1 nm。

1.4.2 電鏡觀察、選區(qū)電子衍射、X 射線能譜分析透射電鏡(TEM)、高分辨透射電鏡(HRTEM)、選區(qū)電子衍射(SAED)、X 射線能譜(EDX)是利用場(chǎng)發(fā)射透射電鏡，在加速電壓為300 kV 下，對(duì)樣品進(jìn)行表征。應(yīng)用Sigma Scan Pro 4 軟件統(tǒng)計(jì)TEM 圖片中金納米顆粒的粒徑，為了確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，統(tǒng)計(jì)的金納米顆粒數(shù)目均在200 個(gè)以上。

1.4.3 X 射線粉末衍射(XRD) 將畢赤酵母干粉與HAuCl4反應(yīng)后的離心物用去離子洗滌5 次，干燥后，利用X 射線粉末衍射儀，以CuKα 為輻射源(λ=0.154 18 nm)，在電壓為40 kV、電流為30 mA 的條件下掃描，掃描范圍為10 ～90°，步長為0.016 7(°)/步，每步掃描時(shí)間約為10 s。

1.4.4 傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR) 將畢赤酵母干粉及畢赤酵母干粉與HAuCl4反應(yīng)后的離心物置于60 ℃烘箱中干燥，將干燥的KBr 粉末取少量待測(cè)樣品均勻混合(KBr 與樣品比例大約為1∶100)，研磨成粉并壓片，用FTIR 光譜儀檢測(cè)樣品的紅外光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 還原條件對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響

2.1.1 吸附時(shí)間 圖1 為時(shí)間對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響，反應(yīng)條件:HAuCl4濃度1.00 mmol/L，畢赤酵母干粉4 g/L，pH 4，溫度30 ℃。

圖1 時(shí)間對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響Fig.1 Effect of adsorption time on adsorption capacity of［AuCl4］－ by Pichia pastoris powder

由圖1 可知，在5 ～20 min 內(nèi)，畢赤酵母干粉對(duì)［AuCl4］－吸附量隨時(shí)間的增加而快速增加，40 min后吸附量隨時(shí)間的增加變化不大，吸附量維持在49.75 mg/g 左右，即40 min 即可達(dá)到吸附平衡。

2.1.2 pH 值 圖2 為溶液pH 值對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響，反應(yīng)條件:HAuCl4濃度1.00 mmol/L，畢赤酵母干濃度4 g/L，溫度30 ℃。

圖2 溶液pH 值對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption capacity of［AuCl4］－ by Pichia pastoris powder

由圖2a 可知，不同pH 值對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響很大，但40 min 之后吸附量變化不大，即達(dá)到吸附平衡。圖2b 為pH 值對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－平衡吸附量的影響，由圖2b可知，pH 在3 ～5 范圍內(nèi)，畢赤酵母干粉對(duì)［AuCl4］－的吸附量在46.93 mg/g 以上，pH =4 時(shí)，其吸附量最大，為49.75 mg/g，這可能是由于在酸性介質(zhì)中，菌體表面的一些功能基團(tuán)，如—NH2質(zhì)子化為—NH3+，使細(xì)胞帶正電，可以與［AuCl4］－產(chǎn)生靜電吸附作用。但是pH≤2 時(shí)，吸附量明顯下降，這可能是由于在強(qiáng)酸性介質(zhì)中，有大量的H+和H3O+形成，它們與細(xì)胞壁上帶正電荷的功能基團(tuán)競爭［AuCl4］－，導(dǎo)致畢赤酵母干粉對(duì)［AuCl4］－的吸附量下降;pH =6 時(shí)，吸附量也明顯下降，這可能是菌體上的羧基等功能基團(tuán)發(fā)生解離形成為—COO－，同時(shí)—NH2以游離的形式存在，使細(xì)胞表面的電負(fù)性增強(qiáng)，不利于［AuCl4］－的吸附，這與劉月英等［12］利用金霉素鏈霉菌廢菌絲吸附［AuCl4］－得到的結(jié)果是一致的，而pH ＞7 時(shí)，吸附量下降更為明顯，這可能是因?yàn)槿芤褐幸肓薕H－，細(xì)胞表面的電負(fù)性更強(qiáng)，使細(xì)胞表面上可與［AuCl4］－結(jié)合的帶正電的官能團(tuán)大大減少?？梢姡芤旱膒H 值對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－的吸附量影響較大。2.1.3 溫度 圖3 為溫度對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響。反應(yīng)條件:HAuCl4濃度1.00 mmol/L，畢赤酵母干粉濃度4 g/L，pH 4，時(shí)間40 min。

圖3 溫度對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響Fig.3 Effect of temperature on adsorption capacity of［AuCl4］－ by Pichia pastoris powder

由圖3 可知，隨溫度的升高(20，25，30，35，40 ℃)，畢 赤 酵 母 干 粉 對(duì)［AuCl4］－的 吸 附 量(48.23，49.34，49.75，49.75，49.75 mg/g)并未發(fā)生明顯的變化，說明畢赤酵母干粉對(duì)［AuCl4］－的吸附作用與溫度的關(guān)系不大。

2.1.4 HAuCl4濃度 圖4 為HAuCl4初始濃度對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響。反應(yīng)條件:畢赤酵母干粉濃度4 g/L，pH 4，溫度30 ℃。

圖4 HAuCl4 初始濃度對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響Fig.4 Effect of the initial concentration of HAuCl4 on adsorption capacity of［AuCl4］－ by Pichia pastoris powder

由圖 4 可知，在 HAuCl4的濃度低于1.00 mmol/L時(shí)，隨著HAuCl4濃度的增加，其平衡吸附量也隨之增大，但HAuCl4的濃度為1. 00，1.25，1.50 mmol/L 這三條吸附曲線基本重疊，這說明，當(dāng)HAuCl4的濃度＞1. 00 mmol/L 時(shí)，隨著HAuCl4的濃度的增加，平衡吸附量基本不變?？梢妼?duì)于4 g/L 的畢赤酵母干粉，當(dāng)HAuCl4的濃度達(dá)到1.00 mmol/L 時(shí)，畢赤酵母干粉表面的吸附位點(diǎn)已經(jīng)基本飽和。

圖5 為不同HAuCl4初始濃度下畢赤酵母干粉吸附還原HAuCl4所制得的金納米顆粒的TEM 圖和粒徑分布圖，反應(yīng)條件:畢赤酵母干粉濃度4 g/L，pH 4，溫度30 ℃，時(shí)間40 min。

圖5 不同HAuCl4 初始濃度下畢赤酵母干粉吸附還原［AuCl4］－所制得的金納米顆粒的TEM 圖和粒徑分布圖Fig.5 TEM photograph of gold nanoparticles prepared by the adsorption and reduction of different initial concentration of HAuCl4 by Pichia pastoris powder and the graphs of particle size distribution a.0.25 mmol/L;b.0.50 mmol/L;c.1.00 mmol/L;d.1.25 mmol/L;e.1.50 mmol/L

由圖5 可知，隨著HAuCl4初始濃度的增大，金納米顆粒的平均粒度隨著濃度的增大而逐漸增大［(2.44 ±0.75)nm、(2.62 ±0. 65)nm、(2. 85 ±0.75)nm、(2.97 ±0.67)nm、(3.02 ±0.75 nm)］，但增大不明顯。

2.2 金納米顆粒的表征

2.2.1 UV-Vis 表征 在HAuCl4濃度為1.00 mmol/L、畢赤酵母干粉濃度為4 g/L、pH 為4、溫度為30 ℃的條件下，發(fā)現(xiàn)溶液的顏色由淡黃色逐漸變?yōu)樽霞t色，表明有金納米顆粒的生成，該溶液隨時(shí)間變化的UV-Vis 吸收光譜圖見圖6。

圖6 畢赤酵母干粉吸附還原氯金酸溶液的UV-Vis吸收光譜圖Fig.6 UV-Vis spectra of the adsorption and reduction of HAuCl4 solution by Pichia pastoris powder

由圖6 可知，在535 nm 處出現(xiàn)金納米顆粒的表面等離子共振吸收峰，并且該峰強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，但在40 min 后吸光度達(dá)到最大，這表明氯金酸還原反應(yīng)的完成。

2.2.2 金納米顆粒的SAED、HRTEM、EDX、XRD表征 圖7a ～圖7d 分別是金納米顆粒的SAED、HRTEM、EDX、XRD 圖，反應(yīng)條件:HAuCl4濃度1.00 mmol/L，畢赤酵母干粉濃度4 g/L，pH 4，溫度30 ℃，時(shí)間40 min。

圖7 畢赤酵母干粉還原制備金納米顆粒表征Fig.7 Characterization of gold nanoparticles prepared by reduction of HAuCl4 solution using Pichia pastoris powder a.SAED 圖;b.HRTEM 圖;c.EDS;d.XRD 圖

由圖7a 可知，所得金納米顆粒具有面心立方金的(111)、(200)、(220)、(311)等4 個(gè)特征晶面，衍射花樣呈環(huán)狀，表明產(chǎn)物為多晶金顆;由圖7b 可知，金納米顆粒的晶面間距約為0.23 nm，與面心立方Au 的(111)面相吻合;由圖7c 可知，選區(qū)中含有大量的Au(其中C、O、N 等元素來自于畢赤酵母干粉殘留的物質(zhì));圖7d 為金納米顆粒的XRD 表征圖，樣品明顯出現(xiàn)了單質(zhì)金晶體的5 個(gè)特征衍射峰，這5 個(gè)特征衍射峰與pdf 卡(pdf 卡片號(hào):00-001-1172)是相吻合的。通過SAED、HRTEM、EDX、XRD 等表征，可以進(jìn)一步證實(shí)畢赤酵母干粉吸附還原氯金酸溶液可制得金納米顆粒。

2.3 FTIR 表征

圖8 給出了畢赤酵母干粉吸附還原HAuCl4前后的FTIR 圖。反應(yīng)條件:HAuCl4濃度1.00 mmol/L，畢赤酵母干粉濃度4 g/L，pH 4，溫度30 ℃，時(shí)間40 min。

圖8 畢赤酵母干粉吸附還原HAuCl4 前后的FTIR 譜圖Fig.8 TIR spectra of yeast Pichia pastoris before and after the biosorption/bioreduction with HAuCl4

圖8a 為畢赤酵母干粉的 FTIR 圖，譜帶3 381 cm－1處為N—H 和O—H 的伸縮振動(dòng)峰，1 651 cm－1處為蛋白質(zhì)酰胺I 帶的 C O伸縮振動(dòng)，1 545 cm－1處為蛋白質(zhì)酰胺II 帶的N—H 彎曲振動(dòng)和C—N 伸縮振動(dòng)，1 400 cm－1處為離子化羧基的CO對(duì)稱伸縮振動(dòng)，而1 240 cm－1的譜帶可能為酰胺III 帶的C—N 伸縮振動(dòng)峰。由圖8b 可知，畢赤酵母干粉吸附還原HAuCl4后，3 381 cm－1和1 651 cm－1的 譜 帶 分 別 藍(lán) 移 至3 409 cm－1和1 655 cm－1，1 400 cm－1處的吸收明顯減弱并紅移至1 384 cm－1，1 076 cm－1的吸收峰遷移至1 074 cm－1，說明了酵母菌上的—COO－、多糖化合物的—OH 和蛋白質(zhì)的酰胺成分可能參與了［AuCl4］－的生物吸附/還原過程(—N…Au，C—O…Au 和—COO…Au)。Lin 等［13］研究了啤酒酵母廢菌絲對(duì)Au3+的吸附過程，F(xiàn)TIR 表征結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)結(jié)束后在1 725 cm－1出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，該峰歸屬于羧基的—CO伸縮振動(dòng)，他們認(rèn)是細(xì)胞還原糖的醛基將Au3+還原成Au。圖8b 曲線在1 700 ～1 800 cm－1并未有新的吸收峰出現(xiàn)，但是1 600 ～1 750 cm－1之間的峰明顯寬化，因此也有可能是附近有一些吸收較弱的峰被掩蓋了。

3 結(jié)論

以畢赤酵母干粉(4 g/L)吸附還原氯金酸制備金納米顆粒，探討了還原條件(時(shí)間、pH 值、溫度、HAuCl4濃度)對(duì)畢赤酵母干粉吸附［AuCl4］－吸附量的影響，結(jié)果表明，畢赤酵母干粉(4 g/L)對(duì)HAuCl4(1.00 mmol/L)吸附的最佳pH 為4，40 min即可達(dá)到吸附平衡(吸附量為49.75 mg/g)。UVVis、SAED、HRTEM、EDX、XRD 表征結(jié)果證實(shí)該法制得了單質(zhì)納米顆粒為金納米顆粒;FTIR 表征，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母菌上的—COO－、多糖化合物的—OH和蛋白質(zhì)的酰胺成分可能參與了［AuCl4］－的生物吸附還原過程。

［1］ 周全法，劉維橋，尚通明.貴金屬納米材料［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

［2］ 黃開金.納米材料的制備及應(yīng)用［M］.北京:冶金工業(yè)出版社，2009.

［3］ Simakin A V，Voronov V V，Shafeev G A，et al.Nanodisks of Au and Ag produced by laser ablation in liquid environment［J］.Chemical Physics Letters，2001，348(3/4):182-186.

［4］ 劉偉，張現(xiàn)平，崔作林，等. 氫電弧等離子體法制備納米金粒子［J］.稀有金屬，2004，28(6):1082-1084.

［5］ Liu X Y，Cui C Y，Cheng Y W，et al.Shape control technology during electrochemical synthesis of gold nanoparticles［J］.International Journal of Minerals，Metallurgy and Materials，2013，20(5):486-492.

［6］ Huang C，Wang Y，Chiu P，et al.Electrochemical synthesis of gold nanocubes［J］. Material Letters，2006，60(15):1896-1900.

［7］ Pal A. Photochemical synthesis of gold nanoparticles via controlled nucleation using a bioactive molecule［J］. Materials Letters，2004，58(3/4):529-534.

［8］ Huang W，Chen S M，Liu Y S，et al.The controlled synthesis of stable gold nanoparticles in quaternary ammonium ionic liquids by simple heating［J］.Nanotechnology，2011，22(2):025602.

［9］ Chen F X，Xu G Q，Hor T S A.Preparation and assembly of colloidal gold nanoparticles in CTAB-stabilized reverse microemulsion［J］. Materials Letters，2003，57 (21):3282-3286.

［10］ Epifani M，Giannini C，Tapfer L，et al. Sol-Gel synthesis and characterization of Ag and Au nanoparticles in SiO2，TiO2，and ZrO2thin films［J］.Journal of the American Ceramic Society，2000，83(10):2385-2393.

［11］鄭炳云，黃加樂，孫道華，等.貴金屬納米材料生物還原制備技術(shù)的研究進(jìn)展［J］. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，50(2):378-386.

［12］劉月英，傅錦坤，胡洪波，等.金霉素鏈霉菌廢菌絲體吸附金(Au3+)特性的表征［J］.科學(xué)通報(bào)，2001，46(14):

1179-1182.

［13］Lin Z Y，Wu J M，Xue R，et al.Spectroscopic characterization of Au3+biosorption by waste biomass of Saccharomyces cerevisiae［J］. Spectrochimica Acta Part A，2005，61(4):761-765.