糖化酵母糖化酶基因在釀酒酵母中的克隆與表達

郭彥言，王紅蕾，左小明*

(長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春 130012)

摘要[目的]使釀酒酵母高效表達糖化酵母糖化酶基因。[方法]利用PCR技術從糖化酵母中擴增出大小為2 700 bp左右的帶有啟動子的糖化酶基因STA1。通過限制性內切酶BspDI與Acc65I雙酶切，將目的基因STA1連接到穿梭質粒pRS416中構建重組質粒pRS416-sta1，轉化釀酒酵母通過篩選。[結果]糖化酶活性最高為120 U/ml，酶的最適溫度為60 ℃，最適pH為5.0，在酶催化反應2 h后，酶剩余活力能達到約90%。[結論]通過基因工程手段得到高效表達糖化酶基因的釀酒酵母工程菌株。

關鍵詞釀酒酵母；糖化酶；糖化酵母；基因表達

中圖分類號S188+.4;Q786

作者簡介郭彥言(1989-)，女，吉林吉林人，碩士研究生，研究方向：基因工程。*

收稿日期2015-06-15

Cloning and Expressing Glucoamylase Gene ofSaccharomycesdiastaticusinSaccharomycescerevisiae

GUO Yan-yan, WANG Hong-lei, ZUO Xiao-ming*(College of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun, Jilin 130012)

Abstract[Objective] Highly expressing glucoamylase gene of Saccharomyces diastaticus in Saccharomyces cerevisiae. [Method] The glucoamylase STA1 gene of 2700 bp with promoter from Saccharomyces diastaticus was amplified by PCR. STA1 was digested by BspDI and Acc65I with Saccharomyces cerevisiae integrative expression vectors pRS416, named pRS416-sta1. This plasmid was introduced into S.cerevisiae. [Result] The glucoamylase levels of Saccharomyces cerevisiae activity was 120 U/ml. The result of determination of enzymatic properties of glucoamylase showed that the optimum temperature of glucoamylase was 60 ℃, the optimum pH of glucoamylase was 5.0. After the enzyme reacted for 2 hours, the remaining enzyme activity achieved 90%. [Conclusion] The result indicated that the plasmid carrying extracellular glucoamylase gene could express in yeast, and this gene product could hydrolyze starch.

Key wordsSaccharomycescerevisiae; Glucoamylase;Saccharomycesdiastaticus; Gene expression

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是發(fā)酵工業(yè)的重要微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工業(yè)[1-2]。淀粉來源廣泛、成本低廉，是一種很有潛力的生物資源，工業(yè)發(fā)酵一直利用淀粉酶來分解利用淀粉。但釀酒酵母由于缺少水解淀粉的酶類不能直接利用淀粉，所以淀粉原料必須先經蒸煮、酶解或酸水解成葡萄糖后被利用[3-5]。

糖化酶主要來源于2種菌株：霉菌和酵母菌[6]。以往研究主要集中于黑曲霉或泡盛酒曲霉等霉菌中糖化酶基因的轉化[7-9]。與霉菌相比糖化酵母與釀酒酵母親緣更近，且產生的糖化酶基因遇熱更不穩(wěn)定，更容易在生產后對其進行滅活，對產物影響更小[10]。

采用基因工程技術，將糖化酶基因導入到釀酒酵母中，構建能產生糖化酶的釀酒酵母工程菌株，可以簡化工藝步驟和設備，大大降低生產成本，具有很高的工業(yè)應用價值。由于提取的目的基因STA1自帶強啟動子，提高了糖化酶基因的表達率。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株和質粒。糖化酵母CICC1868購自北京北納凱創(chuàng)生物技術有限公司；大腸桿菌DH5α為長春工業(yè)大學生物實驗室保存；釀酒酵母AH109購自普如汀生物技術(北京)有限公司；pUM-T載體購自北京百泰克生物技術有限公司；酵母表達質粒pRS416為長春工業(yè)大學生物實驗室保存。

1.1.2 主要培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基(10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，pH7.0)用于培養(yǎng)和篩選大腸桿菌；YPD培養(yǎng)基(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖)用于培養(yǎng)糖化酵母與釀酒酵母；淀粉固體培養(yǎng)基(5 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，2 g/L可溶性淀粉，20 g/L瓊脂，pH7.2)用于釀酒酵母陽性克隆篩選。

1.1.3 主要生化試劑。限制性內切酶BspDI與Acc65I購自上海捷瑞生物工程有限公司；RNA酶購自美國Sigma；T4DNA 連接酶購自TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1 目的基因STA1的PCR擴增。以糖化酵母全基因組為模板[11]；利用Primer Premier 5.0設計引物，上游引物5′-TACTATGGTAGGCCTCAAAAATCGAT-3′，下游引物5′-ACTTAGTTCCCCGTCTGTTCGGTACC-3′；采用Primer Star DNA聚合酶；反應條件為95 ℃ 10 min熱啟動；95 ℃ 30 s、45 ℃ 30、72 ℃ 1 min,35個循環(huán)；72 ℃10 min保溫。

1.2.2 重組質粒pRS416-sta1構建。將pUM-T-sta1用BspDI與Acc65I雙酶切，回收大小為2 700 bp的目的片段，與用同樣的酶切pRS416進行連接，轉化大腸桿菌進行菌落PCR和雙酶切鑒定[12]，并將陽性克隆菌落質粒進行測序，與NCBI中的STA1序列進行比對。

1.2.3 釀酒酵母轉化、篩選和鑒定。將重組質粒pRS416-sta1通過電轉化整合到釀酒酵母菌株中[13]。將轉化后的釀酒酵母接種到篩選平板培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆[14]。將篩選后的陽性克隆點接于淀粉平板培養(yǎng)基中，采用碘熏法進行鑒定，在28 ℃培養(yǎng)2～3 d，用碘蒸汽熏，若在菌落周圍出現(xiàn)透明圈則說明此菌落為糖化酶陽性菌落。

1.2.4 糖化酶酶活測定。將菌株經過誘變處理后，離心取上清液看作粗酶液。采用DNS法[15]測定粗酶液與淀粉反應30 min后產生的還原糖含量與粗酶液原有還原糖含量，兩者相減得到酶液在一定時間內催化淀粉生成葡萄糖的酶量，從而計算出酶活。一個酶活力單位定義為在pH 5.0，溫度60 ℃下1 min酶促反應生成1 mg還原糖含量。

1.2.5 糖化酶酶學性質的測定。分別在40、50、60、70、80 ℃下反應2 h測定原始糖化酵母和轉化釀酒酵母中的糖化酶酶活，繪制最適溫度曲線。分別調節(jié)粗酶液pH 2～8，使酶促反應在60 ℃不同pH中反應2 h測定原始糖化酵母和轉化釀酒酵母中的糖化酶酶活，繪制最適pH曲線。在60 ℃、pH 5.0條件下分別保溫20、40、60、80、120、140、160、180 min，測定不同反應時間下原始糖化酵母和轉化釀酒酵母的酶活，比較2種菌株產生糖化酶的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 重組釀酒酵母表達載體構建

2.1.1目的基因連接并轉化。將從糖化酵母中提取的目的基因STA1連接到pUM-T質粒中并轉化大腸桿菌。篩選出陽性克隆并通過菌落PCR進行DNA電泳鑒定。當轉化空質粒pUM-T時沒有擴增出任何條帶，而轉化重組質粒pUM-T-sta1后在2 700 bp左右出現(xiàn)單一明亮條帶，與目的基因STA1大小相符，結果見圖1。

2.1.2 重組表達質粒構建。用Acc65I與BspDI雙酶切重組質粒pUM-T-sta1與表達載體pRS416，分離提純目的基因STA1并通過T4DNA連接酶與表達載體pRS416連接，構建重組質粒pRS416-sta1，結果見圖2。

2.1.3重組表達質粒pRS416-sta1轉化。將重組表達質粒PRS416-stal轉化釀酒酵母。篩選陽性克隆并提取質粒，通過Acc65I與BspDI雙酶切，DNA凝膠電泳顯示在5 000 bp左右與2 700 bp左右出現(xiàn)亮帶，與質粒大小4 898 bp，目的基因STA1大小2 700 bp大小符合，結果見圖3。進一步測序表明目的基因正確導入釀酒酵母中。

2.2 釀酒酵母陽性克隆鑒定 將轉化后的釀酒酵母點接于淀粉固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h，用碘蒸汽熏染培養(yǎng)基。由圖4可知，轉入重組質粒pRS416-sta1的釀酒酵母菌落周圍出現(xiàn)透明圈，而轉入空質粒pRS416的釀酒酵母菌落周圍沒有出現(xiàn)透明圈。說明糖化酶能在釀酒酵母中表達并分泌到胞外水解淀粉。

2.3糖化酶的SDS-PAGE檢測 對轉化后的釀酒酵母進行SDS-PAGE檢測。目的基因STA1有效片段約為2 400 bp，理論蛋白大小為80 kD左右。SDS-PAGE檢測結果表明，與轉化空質粒的釀酒酵母相比，轉化重組質粒pRS416-sta1的釀酒酵母在80 kD左右出現(xiàn)明顯亮帶，結果與理論蛋白大小相一致(圖5)。

2.4糖化酶酶學性質 將糖化酵母和重組釀酒酵母接種于淀粉液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d，離心取上清液，經過透析和濃縮處理，以5%可溶性淀粉溶液為底物進行酶解反應，采用DNS法測定溶液中還原糖含量以計算酶活，并對比2種菌株中的糖化酶酶學性質。

由圖6可知，重組的釀酒酵母產生的糖化酶最適溫度為60 ℃，最適pH 5.0，在60 ℃、pH 5.0時酶活最高為120 U/ml左右。與原菌株產生糖化酶相比，2種菌株產生糖化酶隨pH與溫度變化基本相同，轉化釀酒酵母后并未影響其酶的性質。

由圖7可知，重組的釀酒酵母產生的糖化酶酶活隨時間變化比糖化酵母的更為穩(wěn)定，轉化后糖化酶在120 min內酶活保持穩(wěn)定，而原始菌株的糖化酶在100 min左右呈現(xiàn)下降趨勢。

2.5重組質粒pRS416-sta1在釀酒酵母中的穩(wěn)定性 將攜帶重組質粒pRS416-sta1的釀酒酵母在無選擇壓力的YPD液體培養(yǎng)基中多次傳代培養(yǎng)后，取樣涂平板，挑取單菌落分別點種于YPD完全培養(yǎng)基和含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2 d。能在YPD培養(yǎng)基中生長，不能在選擇培養(yǎng)基中生長的即為重組質粒丟失的菌落。結果表明，在完全培養(yǎng)基中共生長菌落247個，選擇培養(yǎng)基中共生長菌落224個，所以其丟失率約為9.3%，證明重組質粒pRS416-sta1在釀酒酵母中能穩(wěn)定表達。

3 結論

該試驗成功構建了表達糖化酵母STA1基因的釀酒酵母表達載體，篩選并獲得了能穩(wěn)定表達糖化酶基因的重組釀酒酵母菌株。對比糖化酵母與釀酒酵母產生的糖化酶酶學性質與穩(wěn)定性，結果表明重組菌株產生糖化酶性質與原菌株基本相同，轉化過程并未影響其表達產物活性，且轉化后的糖化酶酶活隨時間變化更加穩(wěn)定，酶促反應2 h后仍有約90%酶活，且得到糖化酶的最適溫度為60 ℃，最適pH為5.0，在此條件下達到最大酶活約為120 U/ml。

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