陳景智,林 娟,葉秀云,徐美愛,李雯娟,鄧香圳(福州大學(xué),福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350116)

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紫色紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的工藝研究

陳景智,林 娟*,葉秀云,徐美愛,李雯娟,鄧香圳
(福州大學(xué),福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350116)

通過培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化提高紫色紅曲霉G6液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶活力。研究接種菌齡、碳源、氮源、金屬離子、培養(yǎng)基初始pH、接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速以及溫度等對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)基配方(w/v)為大米粉8%,蛋白胨1%,KCl 0.1%,ZnSO40.01%,FeSO40.005%,MnSO40.015%,培養(yǎng)基初始pH為4.0;最適發(fā)酵條件:裝液量50 mL/250 mL,轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度32 ℃,接種量12%(v/v);在此條件下發(fā)酵10 d,糖化酶活力為1652.36 U/mL比優(yōu)化前(109.54 U/mL)提高了14.08倍。

紫色紅曲霉,糖化酶,培養(yǎng)基,發(fā)酵條件

紅曲是一種傳統(tǒng)的中藥材,具有消食活血,健脾燥胃,治腳氣、哮喘、咳嗽等作用,早在宋代初期便有用紅曲煮肉的記錄[1]。紅曲菌代謝產(chǎn)物眾多,包括具有降膽固醇功效的Monacolin K[2-3],降血壓活性的氨基丁酸,可促進(jìn)人體對鈣磷吸收的麥角甾醇和作為食用色素的紅曲色素等多種活性物質(zhì)[4],還包括淀粉酶、葡萄糖淀粉酶(糖化酶)、蛋白酶、果膠酶、酯化酶等多種酶類物質(zhì)[5-6]。

糖化酶是世界上生產(chǎn)量最大應(yīng)用范圍最廣的酶類之一,已被廣泛應(yīng)用于葡萄糖、果葡糖漿、釀酒、發(fā)酵食品等工業(yè)。紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的糖化酶和淀粉酶可以作為糖化發(fā)酵劑,釀制成紅曲酒,紅曲酒在我國臺灣、福建、浙江等省享譽(yù)盛名[7],福建古田平湖鎮(zhèn),生產(chǎn)紅曲有1000多年的悠久歷史,在國內(nèi)外久負(fù)盛名。但作為釀造黃酒的古田紅曲,糖化酶活力低,很難適應(yīng)現(xiàn)在的市場要求。

根據(jù)報(bào)道產(chǎn)糖化酶的曲霉以黑曲霉居多,紅曲霉相對較少,高產(chǎn)糖化酶的紅曲霉更為少見[8-11]。本文以古田平湖樣品中篩選、誘變得到的菌株出發(fā),研究紅曲霉菌株產(chǎn)糖化酶的液態(tài)發(fā)酵工藝條件,通過優(yōu)化發(fā)酵工藝提高糖化酶活力,優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)可直接為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo),從而降低生產(chǎn)成本,增加紅曲產(chǎn)品的市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉G6(MonascuspurpureusG6) 由福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育獲得;PDA培養(yǎng)基 配制方法參照文獻(xiàn)[12];種子培養(yǎng)基 不添加瓊脂的PDA培養(yǎng)基;液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基) 葡萄糖5%(w/v),蛋白胨1%(w/v),蒸餾水定容至1 L,pH自然,121 ℃滅菌20 min;液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v,CM培養(yǎng)基) 大米粉8%,蛋白胨1%,KCl 0.1%,ZnSO40.01%,FeSO40.005%,MnSO40.015%,pH4.0,蒸餾水定容至1 L,121 ℃滅菌20 min;蛋白胨 購于Oxiod公司;葡萄糖、可溶性淀粉、KCl、ZnSO4、FeSO4等試劑 均來自國產(chǎn)分析純。

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YXQ-LS-50S11立式蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ZWYR-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司);CF16RXII高速冷凍離心機(jī) 日本HITACHI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫色紅曲霉糖化酶的液態(tài)發(fā)酵 將紅曲菌接種于PDA平板上,在30 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。待紅曲菌長好后,用打孔器在紅曲菌平板上打出6 mm菌餅,將菌餅接種到液體種子培養(yǎng)基中,于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中150 r/min、30 ℃培養(yǎng)2 d,之后以4%(v/v)的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量20%(50 mL/250 mL),于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中180 r/min、30 ℃培養(yǎng)數(shù)天,測定發(fā)酵液的糖化酶活力。

1.2.2 糖化酶活力測定 粗酶液制備:將錐形瓶中發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min,然后取上清液,作為粗酶液。采用DNS比色法測定糖化酶活力[13]。1 mL酶液在40 ℃、pH4.6的條件下,1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖,定義為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。相對酶活力:定義某個(gè)條件下,其相對酶活力為100%,其他條件下酶活力占該條件下酶活力的百分率為相對酶活力。

1.2.3 接種菌齡的確定 將培養(yǎng)不同時(shí)間(1～6 d)的種子液接種于液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基),裝液量20%(50 mL/250 mL),接種量4%(v/v),轉(zhuǎn)速180 r/min,溫度32 ℃,于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d,之后取一定的發(fā)酵液測定糖化酶活力,研究不同接種齡對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

1.2.4 培養(yǎng)基確定

1.2.4.1 優(yōu)化前液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件 葡萄糖5%(w/v),蛋白胨1%(w/v),蒸餾水定容至1 L,pH自然,121 ℃滅菌20 min。種子液培養(yǎng)時(shí)間2 d,溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,裝液量50 mL/250 mL,接種量8%,發(fā)酵培養(yǎng)8 d。

1.2.4.2 碳源確定 分別用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、大米粉、玉米粉、糊精、麩皮作為MM培養(yǎng)基的碳源,添加量均為5%(w/v);培養(yǎng)基初始pH為5.0,裝液量20%(50 mL/250 mL),接種量4%(v/v),轉(zhuǎn)速180 r/min,溫度32 ℃,考察不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響;另外,在確定最佳碳源之后,考察不同添加量4%～16%(w/v)對產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

1.2.4.3 氮源確定 在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上,分別以谷氨酸鈉、尿素、蛋白胨、黃豆餅粉、硫酸銨、酵母膏、大米粉、大豆粉、玉米粉和硝酸鈉為MM培養(yǎng)基的氮源,其他培養(yǎng)條件同1.2.4.2,研究不同氮源對液體發(fā)酵產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響;另外,在確定最佳氮源后,考察不同添加量0.5%～5.0%(w/v)對產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

1.2.4.4 金屬離子優(yōu)化 以最佳的碳源和氮源配制培養(yǎng)基,其他培養(yǎng)條件同1.2.4.2,分別考察添加量0、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%的金屬離子Mn2+、Fe2+、Zn2+,0、0.01%、0.15%、0.20%、0.30%的金屬離子Mg2+和K+對紫色紅曲霉G6產(chǎn)糖化酶能力的影響。進(jìn)一步利用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定這些金屬離子的最優(yōu)配比,因素水平編碼如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4.5 培養(yǎng)基初始pH確定 在通過實(shí)驗(yàn)研究,明確最佳培養(yǎng)基配方之后,調(diào)節(jié)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為2.5～6.0,考察不同初始pH對紫色紅曲霉G6產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

1.2.5 發(fā)酵條件研究 在優(yōu)化后的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(CM培養(yǎng)基)的基礎(chǔ)上,采用單因素實(shí)驗(yàn),固定裝液量50 mL/250 mL、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,溫度32 ℃,考察接種量(2%～16%)對紫色紅曲霉G6產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

固定接種量12%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度32 ℃,考察裝液量(30、50、70、90、110 mL/250 mL)對紫色紅曲霉G6產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

固定接種量12%、裝液量50 mL/250 mL、溫度32 ℃,考察搖床轉(zhuǎn)速(100、120、140、160、180、200、220 r/min)對紫色紅曲霉G6產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

固定接種量12%、裝液量50 mL/250 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,考察溫度(28、30、32、35、37 ℃)對紫色紅曲霉G6產(chǎn)糖化酶相對酶活力的影響。

1.2.6 紫色紅曲霉G6產(chǎn)酶曲線的測定 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵2～11 d,每隔1 d取一定量的發(fā)酵液測一次糖化酶的酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次,采用SPSS 1.70軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌齡對產(chǎn)糖化酶的影響

圖1表明培養(yǎng)2 d的種子液接種發(fā)酵的糖化酶活力最高(定義為100%),這時(shí)紅曲菌處于快速生長期,菌種的生命力及適應(yīng)能力都很強(qiáng),因此選擇種子培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

圖1 接種齡對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.1 Effect of seed age on glucoamylase production

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響 就曲霉而言,糖化酶是誘導(dǎo)酶,所以在微生物發(fā)酵過程中,作為碳源的物質(zhì)除了作為微生物所需碳元素的主要來源外,又是誘導(dǎo)物的主要來源,所以不同的碳源對糖化酶的合成具有顯著的影響[14]。圖2結(jié)果表明,不同碳源對產(chǎn)糖化酶的影響差異較大,碳源為大米粉時(shí)糖化酶活力最高(定義為100%),其次是玉米粉,相對酶活為91.6%?？赡苁且?yàn)檫@類碳源中含有豐富的維生素、有機(jī)酸、氨基酸、糖類等,幾乎包含有微生物生長所需要的絕大部分營養(yǎng)要素,并且配比較為合適。所以,選擇大米粉為產(chǎn)糖化酶培養(yǎng)基中的最適碳源。

圖2 不同碳源對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.2 Effect of carbon sources on glucoamylase production

確定大米粉為最優(yōu)碳源后,進(jìn)一步考察不同添加量對產(chǎn)糖化酶的影響。由圖3可知,碳源添加量為12%時(shí)糖化酶活力最高(定義為100%),當(dāng)添加量從2%增加到8%時(shí),相對酶活從33.68%提高到97.94%;隨著添加量的增加,添加量8%以后,酶活力基本不變,所以,從成本方面考慮,確定大米粉的最適添加量為8%。

圖3 大米粉添加量對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.3 Effect of rice flour content on glucoamylase production

2.2.2 氮源對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響 在最適碳源為大米粉(添加量為8%)的基礎(chǔ)上,研究不同氮源對紫色紅曲霉G6產(chǎn)糖化酶的影響,結(jié)果如圖4所示?？梢钥闯?選用的有機(jī)氮效果優(yōu)于硫酸銨和硝酸鈉等無機(jī)氮。蛋白胨、黃豆餅粉、玉米漿干粉和大米蛋白作為氮源時(shí)的產(chǎn)酶量相近,其中蛋白胨糖化酶活力最高(定義為100%);豆粕由于油脂含量較高,影響了菌體對氮源的利用,使其生長受到抑制,因此糖化酶活力較低。觀察發(fā)酵液顏色,添加黃豆餅粉和玉米漿干粉的發(fā)酵液呈橙紅色,添加大米蛋白的發(fā)酵液呈暗黃色,色澤不佳,可能會(huì)影響到后續(xù)糖化酶的提取和應(yīng)用。在釀造福建黃酒的過程中,紅曲霉發(fā)揮了提供色澤、風(fēng)味和糖化等作用,所以對整體發(fā)酵液的色澤有一定的要求[15-16]。因此確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源為蛋白胨。

圖4 不同氮源對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on glucoamylase production

圖5實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,添加量在1.0%～4.0%范圍內(nèi),產(chǎn)酶水平相近,添加量1.0%時(shí)糖化酶活力最高(定義為100%)。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)以蛋白胨為氮源,添加量為1.0%。

圖5 蛋白胨添加量對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.5 Effect of peptone content on glucoamylase production

2.2.3 金屬離子對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響

圖6 不同金屬離子對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.6 Effect of different metal ions on glucoamylase production

2.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 不同金屬離子以及其不同添加濃度對產(chǎn)糖化酶的影響結(jié)果見圖6,無添加的對照組酶活力定義為100%。Mn2+在實(shí)驗(yàn)濃度0%～0.025%范圍內(nèi)對產(chǎn)糖化酶沒有多大影響,當(dāng)添加量為0.025%時(shí),酶活力略高,僅僅提高了2.4%;Fe2+添加量為0.005%時(shí),相對于無添加時(shí)產(chǎn)酶提高了11.85%;Zn2+在添加量0%～0.025%范圍內(nèi)均對產(chǎn)酶起到了促進(jìn)作用,但隨著濃度的升高,促進(jìn)作用提高不明顯,相對酶活維持在130%左右;Mg2+在添加量0%～0.3%范圍內(nèi)對產(chǎn)酶有抑制作用,相對酶活為90%左右;當(dāng)K+的添加量為0.05%時(shí),對產(chǎn)酶的促進(jìn)作用明顯,較無添加情況下提高了35.0%。

2.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步研究金屬離子對產(chǎn)糖化酶的影響,選擇對酶活有一定促進(jìn)作用的Zn2+、Fe2+、Mn2+和K+,通過正交實(shí)驗(yàn)L9(34)優(yōu)化這4種金屬離子的配比,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由極差R可知,影響糖化酶合成的金屬離子主次順序?yàn)锳>B>D>C,最優(yōu)組合為A2B1C2D3(實(shí)驗(yàn)號4),即添加Zn2+0.010%、Mn2+0.015%、K+0.10%、Fe2+0.005%,紫色紅曲霉G6在該條件下發(fā)酵,糖化酶活力達(dá)到1471.95 U/mL,較優(yōu)化前(109.54 U/mL)提高了13.44倍。

表2 金屬離子L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal experiment(metal ions)

2.2.4 培養(yǎng)基不同初始pH對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響 由圖7可知,在pH3.5～5.0范圍內(nèi),發(fā)酵產(chǎn)酶活力均維持在較高水平,其pH的適應(yīng)范圍較寬,以pH為4.0時(shí)的酶活力最高(定義為100%)。因此,確定培養(yǎng)基初始pH為4.0。

圖7 初始pH對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on glucoamylase production

2.3 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶條件優(yōu)化

2.3.1 不同接種量對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響 由圖8可知,在2%～16%(v/v)接種量范圍內(nèi),糖化酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)接種量為12%時(shí),發(fā)酵產(chǎn)酶效果最好。過高的接種量使得菌體生長旺盛,快速消耗營養(yǎng)物質(zhì),對發(fā)酵產(chǎn)酶不利,所以確定接種量為12%。

圖8 接種量對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on glucoamylase production

2.3.2 不同裝液量對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響 搖瓶裝液量與轉(zhuǎn)速是影響通氣量的兩個(gè)主要因素。裝液量對產(chǎn)糖化酶的影響結(jié)果見圖9,裝液量為30 mL時(shí),糖化酶相對酶活力最高;當(dāng)裝液量為50 mL時(shí),酶活力是裝液量30 mL時(shí)的91.32%,其余的裝液量,酶活力都較低,考慮到投入產(chǎn)出比,選擇搖瓶裝液量為50 mL。

圖9 裝液量對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.9 Effect of medium volume on glucoamylase production

2.3.3 不同轉(zhuǎn)速對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響 在前面的基礎(chǔ)上,搖床轉(zhuǎn)速控制在100～220 r/min范圍內(nèi),糖化酶活力先升后降,在150 r/min時(shí),糖化酶相對酶活力達(dá)到最高(圖10),因此選擇搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖10 轉(zhuǎn)速對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.10 Effect of rotation speed on glucoamylase production

2.3.4 不同溫度對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響 適宜的溫度對于發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大,不同溫度條件下發(fā)酵產(chǎn)糖化酶情況如圖11所示,在溫度為32 ℃時(shí)糖化酶活力最高(定義為100%),在發(fā)酵溫度28 ℃下,相對酶活為71.30%;而在37 ℃下,酶活力迅速下降,相對酶活僅為41.09%,說明高溫不利于紅曲菌株產(chǎn)糖化酶。因此,確定液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶最適溫度為32 ℃。

圖11 發(fā)酵溫度對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.11 Effect of fermentation temperature on glucoamylase production

2.4 紫色紅曲霉G6產(chǎn)酶曲線的測定

將紫色紅曲霉G6按照優(yōu)化后的液態(tài)產(chǎn)酶工藝進(jìn)行發(fā)酵,并繪制產(chǎn)酶曲線,如圖12所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,糖化酶活力不斷升高,在第6 d之后,上升變得相對平緩,直到第10 d達(dá)到最高(糖化酶活力為1652.36 U/mL)。與優(yōu)化前(糖化酶活力為109.54 U/mL)相比,產(chǎn)酶能力提高了14.08倍。

圖12 發(fā)酵時(shí)間對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的影響Fig.12 Effect of fermentation time on glucoamylase production

3 結(jié)論

通過對紫色紅曲霉G6液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶的接種菌齡、培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件的研究,確定其最佳接種菌齡為2 d;最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分為大米粉8%,蛋白胨1%,KCl 0.1%,ZnSO40.01%,FeSO40.005%,MnSO40.015%,pH4.0;最適發(fā)酵條件為裝液量50 mL/250 mL,轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度32 ℃,接種量12%(v/v)。在該條件下發(fā)酵至第10 d糖化酶活力可達(dá)1652.36 U/mL,比優(yōu)化前提高了14.08倍。

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Study on the liquid fermentation conditions of glucoamylase byMonascuspurpureus

CHEN Jing-zhi,LIN Juan*,YE Xiu-yun,XU Mei-ai,LI Wen-juan,DENG Xiang-zhen

(Fujian Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350116,China)

The production conditions of glucoamylase through liquid-state fermentation byMonascuspurpureusG6 were optimized. Based on results of single factor tests,the optimal conditions for glucoamylase production were 8% rice powder,1% peptone,0.1% KCl,0.01% ZnSO4,0.005% FeSO4,0.015% MnSO4,50 mL/250 mL loading medium volume(v/v),12% inoculation amount(v/v)and rotation speed of shaking incubator was 150 r/min,initial pH value of culture medium was 4.0,fermentation temperature was 32 ℃. The fermentation was carried out under these conditions for 10 days to obtain the maximum glucoamylase activity of 1652.36 U/mL,which was 14.08 times higher than that without optimization of fermentation condition.

Monascuspurpureus;glucoamylase;culture medium;fermentation conditions

2016-12-20

陳景智(1991-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)，E-mail：1548426184@qq.com。

*通訊作者:林娟(1970-)，女，博士，教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)、分子酶學(xué)，E-mail:ljuan@fzu.edu.cn。

國家863計(jì)劃課題(2013AA102101)；福建省高校產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目(2017N5008)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0146-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.029