降鈣素基因相關(guān)肽對維甲酸致老年骨質(zhì)疏松大鼠OPG/RANKL信號通路的影響及療效

陳光華黃貴芝林顥吳浩俊陳航

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科中心，廣東湛江524001)

摘要〔〕目的探討降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對維甲酸致老年骨質(zhì)疏松大鼠骨保護素(OPG)/核因子κB受體活化因子配體(RANKL)信號通路的影響及療效。方法72只15月齡雄性SD大鼠隨機分為對照組、維甲酸組、CGRP組和CGRP8-37(CGRP拮抗劑)組，每組18只；后3組用維甲酸80 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃2 w。維甲酸組腹腔注射生理鹽水1 ml，1次/d，6次/w；CGRP組腹腔注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次/d，6次/w；CGRP8-37組先腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP8-37(30 μg/kg)，再向腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次，6次/w；以上各組均干預2 w。采用雙能X射線骨密度儀檢測大鼠股骨骨密度(BMD)；比較各組血清白細胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、OPG和 RANKL水平；RT-PCR法檢測各組大鼠骨組織OPG mRNA和 RANKL mRNA表達。結(jié)果與對照組比較，維甲酸組大鼠左、右股骨BMD明顯降低(P<0.05)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠左、右股骨BMD均顯著升高(P<0.05)；而CGRP8-37組大鼠左、右股骨BMD均明顯低于CGRP組(P<0.05)。與對照組比較，維甲酸組大鼠血清OPG水平和骨組織OPG mRNA表達明顯下降，而血清RANKL、IL-1、IL-6、TNF-α水平和骨組織RANKL mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠血清OPG和骨組織OPG mRNA明顯升高，而血清RANKL、IL-1、IL-6、TNF-α水平和骨組織RANKL mRNA表達顯著降低(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠血清OPG水平和骨組織OPG mRNA明顯低于CGRP組，而血清RANKL、IL1、IL-6、TNF-α水平和骨組織RANKL mRNA顯著高于CGRP組(P<0.01)。結(jié)論降鈣素基因相關(guān)肽可明顯提高維甲酸老年骨質(zhì)疏松大鼠股骨BMD，其作用可能與抑制機體IL-1、IL-6、TNF-α水平從而調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕降鈣素基因相關(guān)肽；維甲酸；骨質(zhì)疏松；骨保護素；核因子κB受體活化因子配體

中圖分類號〔〕R69〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：陳航(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科、骨質(zhì)疏松研究。

第一作者：陳光華(1980-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科、骨質(zhì)疏松研究。

骨質(zhì)疏松臨床以骨量減少和骨組織結(jié)構(gòu)退化為病理特征，由于骨的脆性增加以致易于發(fā)生骨折，為骨科常見病，以中老年人多見〔1〕。目前骨質(zhì)疏松的病因尚不十分清楚，如可能與降鈣素、甲狀旁腺素、性激素以及維生素等代謝異常關(guān)系密切。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)作為一種多生物活性神經(jīng)肽，與降鈣素在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定相似性，近年其對骨質(zhì)疏松的作用受到廣泛關(guān)注。人體破骨細胞和成骨細胞均有CGRP受體，CGRP能夠與這些受體結(jié)合調(diào)節(jié)破骨細胞和成骨細胞的功能，從而對骨的生長、修復以及改建等方面發(fā)揮重要作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP在骨質(zhì)疏松患者外周血中含量明顯增高，且伴隨骨密度(BMD)的降低CGRP含量逐漸升高〔3〕；因此，CGRP在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要調(diào)節(jié)作用；然而，關(guān)于CGRP直接干預治療骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究鮮見報道。本研究采取大鼠維甲酸骨質(zhì)疏松為模型，觀察CGRP及其拮抗劑對股骨BMD的影響以及可能機制。

1資料與方法

1.1動物72只15月齡SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量260～300 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：scxk桂2009-0002；大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食，溫度控制在(24±2)℃，相對濕度控制在(60±2)%，12 h/12 h明暗周期，實驗前適應環(huán)境3 d。

1.2主要試劑與儀器CGRP和CGRP8-37(CGRP受體拮抗劑)購于Sigma公司，維甲酸(純度99.12%)由陜西森弗生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，大鼠血清白細胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)、骨保護素(OPG)ELISA檢測試劑盒由上海廣銳生物科技有限公司提供，Trizol為美國 Invitrogen 公司產(chǎn)品，PCR引物購于大連寶生物公司，反轉(zhuǎn)錄和SYBR Premix Ex TaqTM PCR Kit 為日本 TaKaRa 公司產(chǎn)品；MEDI LINK雙能X線骨密度檢測儀，法國Osteospace公司生產(chǎn)；Model680型酶標儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；ABI7500熒光定量PCR儀為美國Life Technology公司產(chǎn)品。

1.3分組與造?！?〕72只SD大鼠隨機分為對照組、維甲酸組、CGRP組和CGRP8-37組，每組18只；后3組用維甲酸80 mg·kg-1·d-1灌胃，對照組給予等體積蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)2 w，各組大鼠給予相應干預措施；對照組和維甲酸組：腹腔注射生理鹽水1 ml，1次/d，6次/w。CGRP組：腹腔注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次/d，6次/w。CGRP8-37組：先腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP8-37(30 μg/kg)，5～8 min后再向腹腔內(nèi)注射1 ml CGRP(30 μg/kg)，1次，6次/w。以上各組均干預2 w。

1.4大鼠股骨BMD測定大鼠均采取0.2%戊巴比妥鈉溶液(0.01 ml/kg)腹腔注射麻醉，取大鼠左、右股骨，采用雙能X線骨密度儀測定大鼠左、右股骨BMD。

1.5Elisa法檢測大鼠血清指標大鼠均用0.2%戊巴比妥鈉溶液(0.01 ml/kg)腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，正中切口暴露心臟后采血，室溫靜置1 h，離心10 min，取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆?；檢測指標包括血清IL-6、IL-1、TNF-α、RANKL和OPG，均嚴格按ELISA試劑盒操作說明進行。

1.6RT-PCR檢測大鼠骨組織OPG和RANKL mRNA表達大鼠均采取0.2%戊巴比妥鈉溶液(0.01 ml/kg)腹腔注射麻醉，取右下肢1 cm骨組織，充分勻漿，用Trizol法抽提總RNA；取2 μg RNA，行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應；PCR反應條件：94℃預變性處理5 min，94℃變性處理40 s，56℃退火30 s，72℃進行35 s，共反應32個循環(huán)，72℃延伸8 min，采用β-actin為內(nèi)參；OPG上游引物：5’-TGGCTGAGTGTYCTGGTGGA-3’，反義引物：5’TGACGGTmGGGAAAGTGG-3’，產(chǎn)物長度430 bp；β-actin上游引物：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’，反義引物：5’-CGTGAGAAGGTCGGAAGGAA-3’，產(chǎn)物長度527 bp；RANKL上游引物：5’-CTATGATGGAAGGTTCGTGGC-3’；反義引物：5’-CTTGGGATTTTGATGCTGGTT-3’，產(chǎn)物長度319 bp；反應結(jié)束后，擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，mRNA相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。

1.7統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1各組大鼠雙側(cè)股骨BMD比較與對照組比較，維甲酸組大鼠左、右股骨BMD明顯降低(P<0.05)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠左、右股骨BMD均顯著升高(P<0.05)；而CGRP8-37組大鼠左、右股骨BMD均明顯低于CGRP組(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠雙側(cè)股骨BMD比較

與對照組比較：1)P<0.05；與維甲酸組比較：2)P<0.05；與CGRP組比較：3)P<0.05

2.2各組大鼠血清OPG和RANKL水平比較與對照組相比，維甲酸組大鼠血清OPG明顯下降，而RANKL水平明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠血清OPG明顯升高，而RANKL水平顯著降低(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠血清OPG水平明顯低于CGRP組，而RANKL水平顯著高于CGRP組(P<0.01)，見表2。

表2　各組大鼠血清OPG和 RANKL水平比較

與對照組比較：1)P<0.01；與維甲酸組比較：2)P<0.01；與CGRP組比較：3)P<0.01，下表同

2.3各組大鼠骨組織OPG和RANKL mRNA表達比較與對照組比較，維甲酸組大鼠骨組織OPG mRNA表達明顯下降，RANKL mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠骨組織OPG mRNA明顯升高，RANKL mRNA表達明顯下降(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠骨組織OPG mRNA明顯少于CGRP組，RANKL mRNA明顯高于CGRP組(P<0.01)，見圖1和表3。

2.4各組大鼠血清IL-1，IL-6和TNF-α水平比較與對照組相比，維甲酸組大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-α均明顯升高(P<0.01)；與維甲酸組比較，CGRP組大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；CGRP8-37組大鼠血清IL1、IL-6和TNF-α水平均顯著高于CGRP組(P<0.01)，見表4。

圖1　CGRP對OPG和RANKL mRNA表達的影響

組別OPG/β-actinRANKL/β-actinOPG/RANKL對照組0.93±0.060.32±0.012.91±0.4維甲酸組0.38±0.021)0.91±0.041)0.42±0.031)CGRP組0.88±0.052)0.34±0.022)2.59±0.282)CGRP8-37組0.40±0.033)0.89±0.053)0.45±0.023)

表4　各組血清IL-1，IL-6和TNF-α水平比較

3討論

骨重建過程包括兩個過程，即破骨細胞激活骨吸收開始和成骨細胞激活骨形成終結(jié)，期間局部多種因子通過平衡破骨細胞和成骨細胞間的關(guān)系實現(xiàn)骨轉(zhuǎn)換速度的調(diào)控〔5〕；OPG、RANKL、RANK均為TNF超家族成員，對骨的形成和吸收方面發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用〔6〕。RANK作為RANKL目前唯一的已知受體，在破骨前體細胞和成熟破骨細胞表面大量表達，RANK與成熟破骨細胞表面RANKL結(jié)合能夠直接引起破骨細胞的分化和活化〔7〕；而位于破骨細胞前體細胞表面的RANK，已被證實在破骨細胞分化及活化中起到關(guān)鍵作用〔8〕。OPG主要由成骨細胞譜系的各種細胞產(chǎn)生，常以分泌蛋白形式存在，作為RANKL的誘騙受體，競爭性抑制RANKL結(jié)合成骨細胞表面RANK，從而阻斷其信號通路，抑制破骨細胞的生存、分化活化過程，相反促進成熟破骨細胞凋亡〔9〕；因此，在骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡過程中，RANKL/OPG起到重要杠桿調(diào)節(jié)作用。

OPG和RANKL均由成骨細胞產(chǎn)生，也是破骨細胞和成骨細胞之間相互作用的局部調(diào)節(jié)因子之一；OPG/RANKL的比值受骨吸收與骨形成狀況的影響，其高低是破骨細胞誘導分化的關(guān)鍵性因素〔10〕；抑制甚至阻止RANKL與破骨細胞表面RANK相結(jié)合，提高OPG/RANKL比值將抑制破骨細胞活化、分化及程度，從而實現(xiàn)骨質(zhì)疏松防治目的〔10〕。

本研究結(jié)果表明，CGRP可能經(jīng)調(diào)節(jié)OPG/RANKL比值的平衡，抑制破骨細胞活化、分化和成熟，從而阻斷破骨細胞的骨吸收過程，達到治療骨質(zhì)疏松的作用。為了更好地證實上述結(jié)果，本研究在CGRP治療前采取CGRP8-37進行干預，結(jié)果顯示，在影響B(tài)MD水平和調(diào)節(jié)OPG、RANKL表達上明顯低于CGRP組，且與對照組相比變化無顯著差異。

以往通過選擇性切斷大鼠神經(jīng)脛骨骨折模型研究表明，在骨折愈合過程中CGRP可通過平衡OPG/RANKL比值，間接調(diào)節(jié)破骨細胞活化、分化等達到治療骨折愈合的作用〔11〕。CGRP也可促進OPG/RANKL比值升高，本實驗與上述研究報道結(jié)果一致，進一步驗證了本研究結(jié)果的可靠性，提示，CGRP能夠經(jīng)調(diào)節(jié)OPG/RANKL比值來調(diào)節(jié)RANKL-RANKL-OPG體系，進而調(diào)控骨的吸收與形成。那么CGRP是如何作用與OPG/RANKL杠桿的呢？本研究還進一步研究了CGRP對RANKL-RANKL-OPG體系的上游作用途徑的影響；免疫應答因子IL-1、IL-6和TNF-α均能夠誘導成骨細胞RANKL表達以及破骨細胞的產(chǎn)生、活化〔12〕；IL-1能夠誘導破骨細胞TNF 受體相關(guān)因子6的表達，提高RANKL/RANK信號通路級聯(lián)，直接促進破骨細胞的分化〔13〕；TNF-α經(jīng)正向調(diào)節(jié)RANKL產(chǎn)生，進而使破骨細胞形成增多〔14〕。IL-6通過調(diào)節(jié)破骨細胞上RANK表達及成骨細胞上RANKL表達，經(jīng)RANK信號通路促進破骨細胞分化〔15〕。

本研究顯示，CGRP可能經(jīng)抑制大鼠IL-1、IL-6和TNF-α蛋白表達，抑制OPG/RANKL體系，從而調(diào)節(jié)破骨細胞的作用，達到骨質(zhì)疏松治療作用。

我們知道，MAPK介導的信號途徑是RANKL-RANKL-OPG體系向下游傳遞信號的主要通路，那么在CGRP抑制IL-1、IL-6和TNF-α蛋白表達，減弱RANKL-RANKL信號傳遞而增強OPG/RANKL系統(tǒng)的反應中，其對下游信號的調(diào)節(jié)又如何，有待于進一步探討。

4參考文獻

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〔2014-06-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)