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      轉(zhuǎn)化生長因子β1及其受體在血管損傷后內(nèi)膜增殖中的作用

      2015-12-30 09:07:10林志鴻,吳可貴,李庚山
      中國老年學(xué)雜志 2015年8期
      關(guān)鍵詞:緩沖液表型頸動(dòng)脈

      轉(zhuǎn)化生長因子β1及其受體在血管損傷后內(nèi)膜增殖中的作用

      林志鴻1吳可貴1,2李庚山3謝良地1,2藺佩鴻

      (福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科,福建福州350005)

      摘要〔〕目的探討轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGF-β1)及其受體對(duì)血管損傷后內(nèi)膜增殖的作用及機(jī)制。方法培養(yǎng)SD大鼠正常及損傷頸動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及蛋白印跡(Western印跡)方法分別檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)生物學(xué)標(biāo)記物SM22α,Matrix Gla,Osteopontin;TGF-β1,纖維連結(jié)蛋白(FN)及TGF-β1 Ⅰ型和Ⅱ型受體(TGF-β1-RⅠ,TGF-β1-RⅡ)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果①TGF-β1呈濃度依賴性刺激損傷頸動(dòng)脈VSMCs增殖;但在0.2%血清條件下,TGF-β1濃度依賴性抑制正常頸動(dòng)脈VSMCs增殖;②正常組VSMCs SM22α mRNA表達(dá)水平明顯高于損傷組VSMCs;而Matrix Gla及Osteopontin損傷組VSMCs的表達(dá)水平則顯著升高;③損傷組VSMCs TGF-β1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著高于正常組,且FN的合成也較正常組顯著增高;④損傷組TGF-β1-RⅠ mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)與正常組并無明顯差別;但TGF-β1-RⅡ的表達(dá)水平損傷組卻顯著高于正常組。結(jié)論血管損傷后,VSMCs表型發(fā)生改變,呈現(xiàn)異常增殖,合成和分泌TGF-β1及FN明顯增多;TGF-β1對(duì)損傷后VSMCs有顯著促增殖效應(yīng);同時(shí)血管損傷后VSMCs TGF-β1不同受體亞型的表達(dá)也發(fā)生了變化。

      關(guān)鍵詞〔〕轉(zhuǎn)化生長因子β1;血管損傷;平滑肌細(xì)胞

      中圖分類號(hào)〔〕R543.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

      基金項(xiàng)目:福建省教育廳高校新世紀(jì)人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(No.NCETFJ-0609)

      1福建省高血壓研究所

      2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部病房

      3武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科

      第一作者:林志鴻(1970-),男,主任醫(yī)師,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事高血壓、冠心病及心肺復(fù)蘇的基礎(chǔ)與臨床研究。

      血管成形術(shù)后再狹窄是血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)遷移、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌和堆積的結(jié)果。目前認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是促進(jìn)ECM合成的主要因子之一。TGF-β1高表達(dá)與膠原、蛋白聚糖等的增加有明顯的相關(guān)性〔1〕。現(xiàn)已證實(shí)Ⅰ、Ⅱ型受體是TGF-β1的信息傳遞分子,且其不同的濃度可介導(dǎo)TGF-β1不同的生物活性。TGF-β1可刺激培養(yǎng)的高血壓大鼠(SHR)VSMCs的增殖及合成ECM,但抑制WKY大鼠VSMCs的增殖,研究表明此一異?,F(xiàn)象與兩種細(xì)胞上TGF-β1不同受體亞型的表達(dá)差異有關(guān)〔2〕。 與SHR相似,血管損傷后VSMCs也呈現(xiàn)異常增殖現(xiàn)象,但具體機(jī)制尚未完全闡明。本文探討TGF-β1對(duì)損傷后VSMCs增殖及合成ECM的作用、血管損傷后TGF-β1受體表達(dá)的改變。

      1材料與方法

      1.1 材料體重約400~500 g的雄性SD大鼠,由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,RPMI1640干粉(Gibco公司)、小牛血清(CS,上海華美生物工程公司)、胰蛋白酶(DIFCO公司)、TGF-β1(TGF-β1,Sigma)、3H-胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR,中國原子能科學(xué)研究院)、兔抗鼠多克隆的TGF-β1抗體(2 μg/ml,R﹠D System Inc,Minneapolis,MN),兔抗鼠多克隆TGF-β1Ⅰ型受體(TGF-β1-RⅠ)抗體(Santa Cruz Biotechnology),山羊抗鼠多克隆TGF-β1 Ⅱ型受體(TGF-β1-RⅡ)抗體(Santa Cruz Biotechnology)。

      1.2 SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷SD大鼠氯氨酮40 mg/kg麻醉,固定。頸部消毒、分離右頸總動(dòng)脈至動(dòng)脈交叉處,結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端及分枝,同時(shí)暫時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈血流。在離動(dòng)脈交叉處遠(yuǎn)心端約0.5~1 cm處切開頸外動(dòng)脈,插入2F的球囊導(dǎo)管(Baxter Healthcare)約2.0 cm,從導(dǎo)管注入0.08 ml的生理鹽水?dāng)U張球囊,有明顯阻力感后來回拖拉3次,確定造成血管壁損傷后退出球囊導(dǎo)管,在靠近動(dòng)脈交叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈,同時(shí)開放頸內(nèi)及頸總動(dòng)脈使血流再通后,縫合切口。術(shù)后給予青霉素80 mg連續(xù)肌注3 d預(yù)防感染,正常飲水?dāng)z食。

      1.3 SD大鼠頸總動(dòng)脈VSMCs的培養(yǎng)培養(yǎng)SD大鼠頸總動(dòng)脈VSMCs;采用alpha smooth muscle actin單克隆抗體的免疫細(xì)胞熒光進(jìn)行鑒定,細(xì)胞純度達(dá)95%以上。實(shí)驗(yàn)用3~5代VSMCs。

      1.4 TGF-β1對(duì)VSMCs增殖的影響3~5代的培養(yǎng)VSMCs,0.25%的胰酶消化后,調(diào)成約5×104cells/ml的細(xì)胞數(shù),接種于24孔板,每孔1 ml,培養(yǎng)24 h貼壁后,換用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使VSMCs處于G0/G1期,再進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。 0.2%CS、0.2%CS+ TGF-β1(0.01、0.1、1.0、10 ng/ml) 10%CS、10%CS+ TGF-β1(0.01、0.1、1.0、10 ng/ml)。

      1.5進(jìn)行VSMCs DNA合成率的測(cè)定在干預(yù)藥物加入時(shí),同時(shí)加入1 μCi/ml的3H-TdR,共育30 h后,0.25%的胰酶消化,在0.45 μm的微孔濾膜上負(fù)壓抽濾,生理鹽水和10%的三氯醋酸沖洗濾膜,室溫涼干后置入閃爍杯中,加入ppo/popop/二甲苯閃爍液4 ml,靜置過夜后,在液體閃爍計(jì)數(shù)器(Tri-carb 2300,Pakard Co,Lit.,USA)上進(jìn)行放射性強(qiáng)度的測(cè)定。

      1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)應(yīng)用TriPure分離試劑盒(BOEHRINGER MANNHEIM COMPANY),按照說明書要求提取細(xì)胞總RNA。在20 μl的總體積中,加入總RNA 1 μg,2.5 μmol/L的隨機(jī)引物,5 mmol/L的MgCl2,Rasin inhibitor 40 U,逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV,Life Science,St. Petersburg,FL,USA)5 U,1 mmol/L dNTP mix,10×PCR緩沖液2 μl,加DEPC處理水至總體積20 μl;30 ℃,10 min,42℃ 30 min,99 ℃孵育5 min滅活A(yù)MV,反轉(zhuǎn)錄成功的cDNA作為下一步PCR模板。采用18 S rRNA作為內(nèi)參照物,PCR反應(yīng)體系:cDNA 2.0 μl,10× PCR緩沖液2 μl,5 mmol/L的MgCl2,1 mmol/L dNTP混合液4.0 μl,上下游引物各0.2 μmol/L,TaqDNA聚合酶(Takara) 0.625 μl,加滅菌去離子水至總體積20 μl,置于PCR循環(huán)擴(kuò)增儀上擴(kuò)增30~35次循環(huán)。

      PCR擴(kuò)增后,各取10 μl產(chǎn)物,以溴芬藍(lán)作為上樣緩沖液,在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳約45~60 min后,在凝膠分析系統(tǒng)上(美國UVP公司),以18S rRNA作為內(nèi)參照,進(jìn)行產(chǎn)物電泳條帶強(qiáng)度的半定量分析。

      1.7 免疫印跡法(Western印跡)檢測(cè)蛋白表達(dá)培養(yǎng)在6孔板的VSMCs加入裂解緩沖液,4 ℃,13 500 r/min離心10 min;取上清,加入400 μl的甲醇和100 μl的氯仿沉淀蛋白質(zhì),4℃,13 500 r/min離心10 min;去上清,加入100 μl的PBS溶解蛋白質(zhì)沉淀。抽提的蛋白質(zhì)測(cè)定含量,加入樣本緩沖液,按每孔5 μg的蛋白質(zhì)及20 μl的樣本緩沖液,在8%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。電轉(zhuǎn)膜將電泳完畢的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,將膜用100%的Block Ace 4 ℃封閉過夜;最后將不同實(shí)驗(yàn)所得的纖維素膜分別與兔抗鼠多克隆TGF-β1抗體(2 μg/ml),兔抗鼠多克隆TGF-β1-RⅠ抗體(1∶400),山羊抗鼠多克隆TGF-β1-RⅡ抗體(1∶400)或小鼠抗大鼠α-Tublin單克隆抗體作為內(nèi)參照(1∶1 000)室溫孵育振搖3 h,振搖洗滌后,再分別與相應(yīng)的過氧化物酶聯(lián)的IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育振搖1 h;最后經(jīng)ECL(Amersham Pharmacia Biotech)顯影3~10 min,X線曝光顯影。圖像處理系統(tǒng)掃描膠片,測(cè)定感光區(qū)帶的感光密度。

      2結(jié)果

      2.1 TGF-β1對(duì)SD大鼠正常及損傷頸動(dòng)脈VSMCs增殖的影響在0.2%血清和10%血清條件下,0.01~10 ng/mlTGF-β1均呈濃度依賴性刺激SD大鼠損傷頸動(dòng)脈VSMCs增殖和DNA合成(P<0.05);而在0.2%血清條件下,TGF-β1濃度依賴性抑制SD大鼠正常頸動(dòng)脈VSMCs增殖(P<0.05);但在10%血清濃度,TGF-β1對(duì)正常頸動(dòng)脈VSMCs增殖的抑制作用不明顯,對(duì)DNA合成有輕微的刺激作用。見表1。

      表1 不同濃度TGF-β1對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈損傷后

      與同一濃度正常組比較:1)P<0.05

      2.2 血管損傷后頸動(dòng)脈VSMCs表型的變化標(biāo)記VSMCs收縮表型的SM22α,正常組VSMCs mRNA表達(dá)明顯高于損傷組(0.66±0.07 vs 0.47±0.04,P<0.05);而標(biāo)記VSMCs合成表型的Matrix Gla及 Osteopontin,損傷組VSMCs表達(dá)水平則顯著升高(0.59±0.03 vs 0.06±0.01,P<0.01;0.4±0.01 vs 0.12±0.03,P<0.01)。見圖1。

      圖1 頸動(dòng)脈損傷后VSMCs表型標(biāo)記物SM22α,Matrix Gla和Osteopontin mRNA表達(dá)水平的變化

      2.3 血管損傷對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈VSMCs FN,TGF-β1及其受體mRNA表達(dá)的影響血管損傷后,損傷組VSMCs,TGF-β1 和FN mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組(0.68±0.03 vs 0.5±0.03,P<0.01;0.35±0.03 vs 0.04±0.01,P<0.01)。血管損傷后,損傷組TGF-β1-RⅠ表達(dá)與正常組無明顯差別(0.48±0.03 vs 0.39±0.05,P>0.05);但TGF-β1-RⅡmRNA的表達(dá)水平卻顯著高于正常組(0.85±0.09 vs 0.41±0.1,P<0.05),TGF-β1-RⅠ/ TGF-β1-RⅡ下降。見圖2,圖3。

      圖2 血管損傷對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈VSMCs FN,TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

      圖3 血管損傷對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈TGF-β1 受體mRNA表達(dá)的影響

      2.4 血管損傷對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈VSMCs TGF-β1及其受體蛋白質(zhì)表達(dá)的影響血管損傷后,損傷組VSMCs TGF-β1及其受體亞型蛋白質(zhì)的表達(dá)與相應(yīng)mRNA的表達(dá)變化一致。血管損傷后,損傷組TGF-β1的蛋白表達(dá)水平增加,顯著高于正常組(0.82±0.17 vs 0.32±0.12,P<0.05)。損傷組TGF-β1-RⅠ蛋白質(zhì)表達(dá)與正常組并無明顯差別(0.47±0.04 vs 0.54±0.05,P>0.05);但損傷組TGF-β1-RⅡ蛋白質(zhì)的表達(dá)水平卻顯著高于正常組,是其的5.3倍(0.83±0.08 vs 0.16±0.05,P<0.01)。見圖4,圖5。

      圖4 血管損傷對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈VSMCs TGF-β1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

      圖5 血管損傷對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈VSMCs TGF-β1 受體蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

      3討論

      ECM主要是由增生的VSMCs和成纖維細(xì)胞所分泌,主要有膠原、彈力纖維、FN及層LN等。ECM的過量分泌和積蓄是損傷后內(nèi)膜增厚的主要原因之一〔1〕。

      本研究結(jié)果表明,血管損傷后,VSMCs中TGF-β1及FN的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯增加;在體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)血管損傷后4 w,在內(nèi)膜顯著增厚的同時(shí),內(nèi)膜中細(xì)胞外基質(zhì)FN、LN和TGF-β1的含量較正常組明顯增加〔3〕。表明血管損傷后,VSMCs合成和分泌TGF-β1及FN、LN增多,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在內(nèi)膜中沉積,引起內(nèi)膜的增厚。

      心血管系統(tǒng)中的TGF-β主要是TGF-β1,它可促進(jìn)內(nèi)皮再生和血管生長;促進(jìn)成纖維細(xì)胞和VSMCs增生,使ECM的合成和分泌增加,而且還可抑制基質(zhì)蛋白的降解。因此可能在機(jī)械性血管損傷和介入治療后再狹窄的內(nèi)膜增生過程中起重要作用〔4,5〕。

      本研究結(jié)果表明,在0.2%血清時(shí),TGF-β1表現(xiàn)為濃度依賴性抑制正常VSMCs的增殖,卻顯著促進(jìn)了頸動(dòng)脈損傷大鼠VSMCs的增殖;10%血清條件下,TGF-β1仍顯著促進(jìn)損傷大鼠VSMCs增殖,對(duì)正常組的VSMCs,TGF-β1的抑制作用并不明顯。這種血管損傷后,TGF-β1對(duì)VSMCs的生物學(xué)作用發(fā)生根本性的變化,由抑制細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)為促細(xì)胞增殖,促進(jìn)ECM的合成,其機(jī)制尚不明確,可能與血管損傷后VSMCs的表型發(fā)生了轉(zhuǎn)變有關(guān)。有研究表明TGF-β1對(duì)VSMCs的增殖具有雙重效應(yīng),可能與細(xì)胞密度、細(xì)胞表型、共同培養(yǎng)的因子及TGF-β1的濃度等有關(guān)〔6〕。

      本研究也證實(shí)了血管損傷后,VSMCs的表型發(fā)生了變化,由原來未損傷前的收縮表型向損傷后的合成表型轉(zhuǎn)變。血管損傷后,VSMCs收縮表型標(biāo)記物SM22α mRNA表達(dá)明顯下降,而標(biāo)記合成表型的Matrix Gla及Osteopontin mRNA表達(dá)水平卻顯著增加。

      因此,血管損傷后,由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇偷腣SMCs,除了本身合成更多的生長因子和血管活性物質(zhì)外〔7〕,同時(shí)其對(duì)各種生長因子和血管活性物質(zhì),包括對(duì)TGF-β1的反應(yīng)性也發(fā)生了變化,使TGF-β1由原來的抗增殖轉(zhuǎn)變?yōu)榇僭鲋匙饔茫瑥亩龠M(jìn)血管損傷后再狹窄的發(fā)生和發(fā)展。

      除VSMCs的表型改變,有研究顯示TGF-β1不同受體亞型的變化可能也參與TGF-β1促進(jìn)VSMCs的異常增殖過程。在體研究也證實(shí)內(nèi)膜剝脫損傷的血管,損傷處TGF-β1及TGF-β1-RⅡmRNA水平明顯高于正常內(nèi)膜處〔8〕。預(yù)先在損傷頸動(dòng)脈增生的內(nèi)膜注射重組可溶性的TGF-β1-RⅡ(TGF-βR:Fc),可明顯減輕內(nèi)膜肥厚和增加管腔面積〔9〕。

      本研究結(jié)果顯示血管損傷后,培養(yǎng)的VSMCs TGF-β1兩種受體亞型的表達(dá)發(fā)生了變化,TGF-β1-RⅠ的表達(dá)水平在損傷前后的VSMCs無明顯差異,而TGF-β1-RⅡ的表達(dá)水平則較正常組明顯增加,其蛋白表達(dá)水平為正常的5.3倍。因此TGF-β1-RⅡ表達(dá)水平的增加可能參與了TGF-β1促進(jìn)損傷大鼠VSMCs的異常增殖。

      血管損傷后VSMCs呈現(xiàn)異常增殖現(xiàn)象,而TGF-β1在血管損傷后呈現(xiàn)持續(xù)的高表達(dá),且促進(jìn)損傷血管VSMCs的增殖和ECM合成,此一作用可能與血管損傷后VSMCs的表型改變及TGF-β1受體亞型的表達(dá)發(fā)生變化有關(guān)。預(yù)示TGF-β1及其受體有望成為預(yù)防和減輕血管損傷后內(nèi)膜增殖,肥厚及再狹窄形成的重要靶點(diǎn),有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

      4參考文獻(xiàn)

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      〔2013-12-03修回〕

      (編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

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