菌核側(cè)耳液體培養(yǎng)及胞外聚合物成分分析

易駿1陳體強(qiáng)2

(1.福建教育學(xué)院理科研修部，福建福州350025；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建福州350013)

摘要：文章旨在探明不同碳源和氮源對菌核側(cè)耳菌絲生長及胞外聚合物動態(tài)積累和化學(xué)成分組成影響。采用液體發(fā)酵培養(yǎng)研究結(jié)果表明：菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌絲體在以果糖為碳源的培養(yǎng)液中菌絲生長好于葡萄糖為碳源，生物轉(zhuǎn)化率37.18~48.53%，菌絲(凍干)產(chǎn)量12.640.41~16.500.51g/L；以酵母粉為氮源的菌絲生長好于蛋白胨為氮源，生物轉(zhuǎn)化率28.06~33.68%，菌絲產(chǎn)量9.540.79~11.450.73g/L。胞外聚合物含量在接種后的6~14d或6~20d均有一個平穩(wěn)的高含量，在葡萄糖-酵母粉Gpy培養(yǎng)基中胞外聚合物含量(0.12~0.16g/L)明顯高于以果糖-酵母粉Fpy培養(yǎng)基(0.11~0.12g/L)。氣相色譜法分析表明：菌核側(cè)耳(虎奶菇)胞外聚合物的單糖組成主要為葡萄糖、甘露糖和半乳糖，而且胞外聚合物含量高于單糖組分的總和，是一種雜多糖。本研究確定可以利用果糖-酵母粉培養(yǎng)基進(jìn)行菌體增量培養(yǎng)，同時利用葡萄-糖酵母粉培養(yǎng)基進(jìn)行胞外聚合物的增量培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：菌核側(cè)耳；液體培養(yǎng)；菌絲產(chǎn)量；胞外聚合物；成分分析

作者簡介：易駿(1966-)，女，福建福州人，福建教育學(xué)院理科研修部副教授。

中圖分類號：1Q939.5；S567.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

收稿日期：2015-01-10

基金項(xiàng)目：2012年福建省科技廳工業(yè)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2012H0008)

菌核側(cè)耳Pleurotustuber-regium(Fr.)Singer.也稱虎奶菇，主產(chǎn)非洲，我國主要分布在云南省藤沖和章鳳縣一帶[1]，以菌核入藥，用于治療便秘、胃痛、天花、糖尿病等癥。[2]國內(nèi)外均有報道菌核側(cè)耳的栽培[1，3]，從菌絲到菌核往往需要較長時間(4~11個月)的生長過程。菌絲的發(fā)酵培養(yǎng)長期以來一直被認(rèn)為是操作簡單、快速和高效的菌絲生產(chǎn)方法；但菌核側(cè)耳菌絲液體發(fā)酵培養(yǎng)的生物轉(zhuǎn)化率低，只有20%~30%[4]，而且菌絲產(chǎn)量較低。[5]

微生物代謝過程常產(chǎn)生胞外聚合物(exo-polymer)，包括多糖、核酸和蛋白質(zhì)。真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)中菌絲體所分泌的胞外聚合物具有多種的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)劑、抗腫瘤和降血脂。[6，7]鑒于真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲生長速度快，對真菌菌絲分泌的胞外聚合物研究，也引起國外學(xué)者的興趣[8]，如胞外聚合物分泌的適宜條件[9](化學(xué)結(jié)構(gòu)[10]、生物活性等[11]；但對菌核側(cè)耳(P.tuber-regium)液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲所分泌的胞外聚合物迄今尚未研究。文章報道不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響、菌絲分泌胞外聚合物含量和單糖組成，為進(jìn)一步研究液體發(fā)酵培養(yǎng)菌核側(cè)耳菌絲所分泌的胞外聚合物生物活性提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種及培養(yǎng)基試劑

菌核側(cè)耳菌種由福建省三明真菌研究所黃年來研究員鑒定，低溫保存在PDA培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基成分蛋白胨和酵母粉由美國Difco Laboratories產(chǎn)品，果糖、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂及各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品均由美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2菌絲體培養(yǎng)

培養(yǎng)基配制：按表1培養(yǎng)基配方要求稱取試藥，分裝到500ml三角燒瓶，每瓶200mL，瓶口采用鋁箔密封，置121Co，1.02kg/cm2蒸汽消毒30min，室溫放冷，備用。

菌種液的制備：取經(jīng)PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)活化后的菌絲5-6cm，在無菌條件下，加入50mL無菌水，搗碎，備用。

接種：在無菌條件下，向每瓶培養(yǎng)基加入2mL的菌種液，置同一搖床中，在30±1Co和200±10rpm條件下培養(yǎng)。

表1　菌核側(cè)耳液體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方(g/L)

1.3菌絲體采收

終止培養(yǎng)：確定終止培養(yǎng)時間為接種后第20d[3]，分析不同液體培養(yǎng)基對菌絲生長的影響。從接種后的第4d起，每隔1d，采收3瓶，到第30d止，用于分析不同液體培養(yǎng)基中菌絲分泌胞外聚合物變化規(guī)律。

離心收集：將終止培養(yǎng)的培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離，收集菌體和培養(yǎng)液；J2-MI型低溫離心機(jī)(美國Beckman)，離心溫度10Co，時間10min，轉(zhuǎn)速4800rpm。離心得到的菌絲經(jīng)過蒸餾水清洗后，采用(德國Christ)Alpha 1-2型冷凍干燥機(jī)冷干(-41Co，110mbar)菌體，稱重。

1.4胞外聚合物提取

向離心后的培養(yǎng)基中加入95%的乙醇，使溶液中的乙醇濃度最終達(dá)到78%，溶液出現(xiàn)白色絲狀沉淀(胞外聚合物)，放置過夜，用玻璃棒輕輕挑起，再用78%乙醇漂洗5次，沉淀物經(jīng)(-44Co，80mbar)冷凍干燥后稱量。

1.6胞外聚合物單糖組成成分分析[12]

樣品制備：精密稱取經(jīng)冷凍干燥的胞外聚合物15mg，經(jīng)12M硫酸30Co水浴水解1h，然后在2mol·L-1硫酸100Co水浴水解1h，向水解液中加入-D-allose(阿絡(luò)糖，內(nèi)標(biāo))。再按文獻(xiàn)描述方法進(jìn)行糖的乙?；幚砗笊蠙C(jī)。精密稱取單糖標(biāo)準(zhǔn)品(包括-D-allose)，按同樣的方法進(jìn)行酸水解，乙?；幚砗笊蠙C(jī)。

分析儀器：HP-6890型氣相色譜儀(美國)，Alltech DB-225毛細(xì)管柱(15×0.25mm，i.d.，0.25μm)。

分析條件：程序升溫：初始柱溫180Co，持續(xù)4min；然后以2Co/min的速度上升到220Co，在220Co處維持25min。載氣：氦氣?；鹧骐x子檢測。

單糖組成含量校正：多糖經(jīng)過酸水解成單糖過程中吸收多分子的水，因此，計算單糖組成含量時，對五碳糖、甲基五碳糖、六碳糖分別乘以0.88、0.89、0.90。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)液對菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌絲生長的影響

不同培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)20d后，菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌絲體產(chǎn)量及生物轉(zhuǎn)化率有明顯差別。(表2)

表2　不同培養(yǎng)基菌絲干重、生物轉(zhuǎn)化率比較(n>3)

注：*生物轉(zhuǎn)化率為菌絲干重占培養(yǎng)基中有機(jī)物總量的比

Note：*The bioconversion efficiency was calculated as：[Dry weight of mycelium/Total weight of carbon and nitrogen compounds in the medium]×100%

由表2可見，在缺乏碳源和氮源的培養(yǎng)基中，菌絲幾乎無法生長(0.09g/L)；只有碳源缺乏氮源或只有氮源缺乏碳源的培養(yǎng)基(編號P、Y、Py、M)中，菌絲生長緩慢，產(chǎn)量低(0.33~1.12g/L)。相應(yīng)氮源對不同碳源(Gy/Fy，Gp/Fp，Gpy/Fpy)培養(yǎng)基對菌絲生長有較大的影響，以果糖為碳源的培養(yǎng)基菌絲生長均較葡萄糖為碳源的好，表現(xiàn)在較高菌絲干重和菌絲生物轉(zhuǎn)化率(Fy>Gy，F(xiàn)py>Gpy)，而且差異顯著(p<0.05)；這可能與酮糖(果糖)較醛糖(葡萄糖)在磷酸化后更容易進(jìn)入呼吸代謝途徑有關(guān)。[4]同樣，相應(yīng)碳源對不同氮源的培養(yǎng)基(Gp/Gy，F(xiàn)p/Fy)，菌絲干重和轉(zhuǎn)化率也不同；而且是單獨(dú)使用酵母粉較與蛋白胨互用或單獨(dú)使用蛋白胨均好，表現(xiàn)在較高菌絲干重和菌絲生物轉(zhuǎn)化率(Gy>Gpy或Gp，F(xiàn)y>Fpy或Fp)，而且差異顯著(p<0.05)，主要是由于酵母粉還含有游離氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分[4]，因此，菌絲在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基(編號Gy，Gpy，F(xiàn)y，F(xiàn)py)中長勢好，有較高的產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率。在以果糖為碳源、酵母粉為氮源的Fy培養(yǎng)基中，菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌絲體生長最好，菌絲干重可達(dá)16.50±0.51g/L，生物轉(zhuǎn)化率達(dá)48.53%。

2.2在液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，胞外聚合物及其單糖組成成分含量變化

不同培養(yǎng)階段，胞外聚合物含量不同，結(jié)果見表3和表4和圖1。培養(yǎng)基Gpy和Fpy分別在接菌的第6d到20d和第6d到第14d均有一個平穩(wěn)的高含量，最高達(dá)0.16g/100mL；以葡萄糖為碳源的Gpy培養(yǎng)基，雖然菌絲生物轉(zhuǎn)化率(28.06%)不及以果糖為碳源的Fpy培養(yǎng)基(37.18%)高，但胞外聚合物含量(0.12~0.16g/100mL，培養(yǎng)6~18d)卻較果糖為碳源的培養(yǎng)基(0.9~0.12g/100mL，培養(yǎng)6~18d)高。兩種培養(yǎng)基中的胞外聚合物含量均隨著培養(yǎng)時間的延長而下降(圖1)，表明胞外聚合物不斷地發(fā)生被水解，但構(gòu)成的單糖種類卻增加，如木糖、夫糖等。單糖的組成中主要以葡萄糖和甘露糖為主，其次是半乳糖，這三種單糖的含量變化規(guī)律與胞外聚合物含量變化規(guī)律基本一致。說明胞外聚合物不斷地被水解與這三種單糖被水解有關(guān)。

表3　不同培養(yǎng)時間Gpy培養(yǎng)基中胞外聚合物及其單糖組成與含量* Table3　The exo-polymer yield and its monosaccharide compositions and contents in Gpy liquid medium during different incubation time

注：﹡兩個處理的平均值(n=2)

Note：﹡Mean value of two measurements

表4　不同培養(yǎng)時間Fpy培養(yǎng)基中胞外聚合物及其單糖組成與含量* Table 4　The exo-polymer yield and its monosaccharide compositions and contents in Fpy liquid medium during different incubatio

注：﹡兩個處理的平均值

Note：﹡Mean value of two measurements

圖1 Gpy和Fpy培養(yǎng)基中胞外聚合物含量變化 Fig1 The variations ofexo-polymer contents in Gpy and Fpy after incubation

菌核側(cè)耳胞外聚合物的含量高于構(gòu)成胞外聚合物單糖含量的總和。如在Gpy培養(yǎng)基中6d、10d與18d的胞外聚合物含量均達(dá)160mg/100mL(表3)，而其單糖組分總和分別僅為54.85mg/100mL、58.57mg/100mL和48.53mg/100mL；再如在Fpy培養(yǎng)基中8d、14d的的胞外聚合物含量均達(dá)120mg/100mL(表4)，而其單糖組分總和分別僅為66.73mg/100mL、58.44mg/100mL。據(jù)此可以斷定，菌核側(cè)耳的胞外聚合物應(yīng)該是雜多糖。據(jù)報道，真菌菌絲體胞外聚合物組分中除了含有糖外，還含有氨基酸、短肽、脂質(zhì)等非糖物質(zhì)。[10]

3討論

3.1菌核側(cè)耳液體培養(yǎng)及終止時間

據(jù)報道，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)菌核側(cè)耳菌絲的產(chǎn)量有較大的差異。如以玉米、麥芽糖組成菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)量為6.38~8.63g(菌絲干重)/L培養(yǎng)液，而以馬鈴薯、蔗糖、蛋白胨和酵母膏組成的培養(yǎng)基，菌絲產(chǎn)量可達(dá)1.075g/100mL[5]。菌絲在不同的終止培養(yǎng)時間，菌絲產(chǎn)量不同，影響結(jié)果的判斷。[3]菌絲產(chǎn)量隨液體發(fā)酵培養(yǎng)的不同階段而變化，主要是由于菌絲在生長過程中不斷地向培養(yǎng)基中分泌酶，如胞內(nèi)葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和幾丁質(zhì)酶等，由于這些水解酶的存在對菌絲產(chǎn)生分解，使菌絲不斷自溶，因此，菌絲的產(chǎn)量隨液體發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長而降低，表現(xiàn)在生物轉(zhuǎn)化率降低，即產(chǎn)量下降。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲，其產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵培養(yǎng)時間而不同，以單糖為培養(yǎng)基碳源的菌絲表現(xiàn)在生長后期生物轉(zhuǎn)化率曲線平穩(wěn)，與以多糖為培養(yǎng)基碳源的完全不同，這與菌絲生長初期，多糖不能被菌絲直接利用有關(guān)。[3]多糖為碳源的菌絲，在培養(yǎng)后期快速自溶，因此，菌絲的產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率高低不僅與培養(yǎng)基種類有關(guān)，而且與培養(yǎng)的終止時間有關(guān)，一般菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌絲液體發(fā)酵培養(yǎng)終止時間為接種后的第20d為好。[3]本實(shí)驗(yàn)以單糖為碳源，因此，選擇在接菌后期第20d為終止培養(yǎng)時間。

3.2菌絲產(chǎn)量與胞外聚合物產(chǎn)量的關(guān)系

本研究結(jié)果表明：在以葡萄糖為碳源、酵母粉為氮源的Gpy培養(yǎng)基中，雖然菌絲體生長相對慢，產(chǎn)量較低(11.45±0.73g/L)且生物轉(zhuǎn)化率低(33.68%，P<0.01)；但在接種后的第6d到第14d終止培養(yǎng)時，胞外聚合物含量高。據(jù)前人的研究結(jié)果[3]，菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌絲生物轉(zhuǎn)化率高的培養(yǎng)液中胞外聚合物含量卻低，該結(jié)果與Kim S.W.等報道一致。[8]真菌菌絲在液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，不僅利用培養(yǎng)基中固有的營養(yǎng)成分，而且菌絲產(chǎn)生自溶或向培養(yǎng)基中分泌聚合物，改變培養(yǎng)基中的成分組成，特別是增加胞外聚合物。本研究確定可以利用果糖-酵母粉培養(yǎng)基進(jìn)行菌體增量培養(yǎng)；利用葡萄糖-酵母粉培養(yǎng)基進(jìn)行胞外聚合物的增量培養(yǎng)，而且胞外聚合物含量普通高于靈芝菌(Ganodermalucidum，0.12g/100mL)。[8]

3.3菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌體胞外多聚物

隨著從多種真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分離出胞外聚合物的藥理作用得到闡明，對胞外聚合物的產(chǎn)量影響因素、化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的研究引起關(guān)注。[8]

有報道從Paecilomycessinclairii，Auriculariapolytricha，Phellinusgilvus，Lentinusedodes和Ganodermalucidum等菌絲液體發(fā)酵培養(yǎng)液中分離到多種胞外多聚物。[7，9，10]大量研究表明，真菌菌絲在液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中不斷地向培養(yǎng)基分泌的胞外多聚物，具有不同程度的降血糖降血脂和抗腫瘤和提高機(jī)體免疫作用[9，10]。多糖是一類具有免疫功能和抗腫瘤作用的大分子聚合物，在過去的幾十年，一直為人們所重視；菌核側(cè)耳(虎奶菇)菌絲胞外多聚物(水溶性胞外多糖)是否有抗腫瘤和提高集體免疫作用將得到進(jìn)一步研究。

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