基于多波長(zhǎng)覆蓋融合指紋圖譜的大川芎片主要成分研究

唐爽1，包永睿1,2,3，孟憲生1,2,3，富力4，王帥1,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；

3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；4.大連富生天然藥物開(kāi)發(fā)有限公司，遼寧 大連 116600)

摘要：目的建立10批次大川芎片多波長(zhǎng)融合高效液相色譜指紋圖譜，在此基礎(chǔ)上對(duì)大川芎片融合指紋圖譜共有峰進(jìn)行初步指認(rèn)，構(gòu)建大川芎片的全析指紋圖譜為其全面的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法采用高效液相色譜法對(duì)大川芎片進(jìn)行檢測(cè)，將不同波長(zhǎng)下數(shù)據(jù)進(jìn)行多波長(zhǎng)融合得到10批大川芎片的融合指紋圖譜，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)融合指紋圖譜中的共有峰進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果10批大川芎片融合指紋圖譜共獲得13個(gè)共有峰并與共有模式圖相似度均>0.92，其中8個(gè)共有峰得到指認(rèn)。結(jié)論本文通過(guò)多波長(zhǎng)融合技術(shù)手段及HPLC-MS分析方法建立大川芎片全析指紋圖譜，為大川芎片主要成分的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為規(guī)范中藥制劑及其合理使用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大川芎片；多波長(zhǎng)融合；指紋圖譜；液質(zhì)聯(lián)用

基金項(xiàng)目：“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(No.2013ZX09507005)

作者簡(jiǎn)介：唐爽，女，研究方向：藥物分析，E-mail：707547627@qq.com

通訊作者：孟憲生，男，博士研究生，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥組分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析，Tel：0411-85890185，E-mail：mxsvvv@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Study on the main components of the Dachuanxiong Tablets based

on multiple wavelength coverage fusion fingerprint

TANGShuang1,BAOYong-rui1,2,3,MENGXian-sheng1,2,3,FULi4,WANGShuai1,2,3

(1.CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；

2.LiaoningProvinceMulti-ComponentChineseMedicineEngineeringTechnologyResearchCenter，

Dalian116600，China；3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchand

EngineeringLaboratory，Dalian116600，China;4.DalianFushengNaturalDrug

DevelopmentCo.,Ltd.，Dalian116600，China)

Abstract：ObjectiveTo set up the multi-wavelength fusion HPLC fingerprint of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets,common peaks were preliminary identified on that basis,building the total analyzed fingerprint in order to provide a base for the comprehensive quality controlling of the drug.MethodsThe fingerprint under different wavelength for ten batches of Dachuanxiong Tablets were tested by HPLC-DAD and the active components was identified by HPLC-MS.ResultsA HPLC fingerprinting pattern of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets was set up based on multi-wavelength fusion,which demarcated 13 common peaks,8 of which were confirmed,the similarity was more than 0.92 between the correlation coefficients of the 10 samples.ConclusionIn this article,with the method of multi-wavelength fusion and HPLC-MS,we established the total analyzed fingerprint of Dachuanxiong Tablets and provided the foundation for the quality controlling of the tablets,which laying a foundation to regulate traditional Chinese medicine preparations and its reasonable application.

Key words:Dachuanxiong Tablets；Multiple wavelength fusion；Fingerprint；HPLC-MS

大川芎片由天麻、川芎兩味藥材組成，經(jīng)提取、精制等一系列工藝處理后制成，具有活血化淤、平肝熄風(fēng)之功效，專(zhuān)門(mén)用于治療各種頭痛和眩暈，療效確切、毒副作用少，已廣泛應(yīng)用于臨床。該制劑組方藥材成分復(fù)雜，單一成分、單一波長(zhǎng)測(cè)定不能全面、綜合的評(píng)價(jià)其質(zhì)量，因此建立綜合、全面、有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)具有重大的意義。中藥指紋圖譜是中藥質(zhì)量控制的有效技術(shù)手段，大川芎片中的有效成分在單一波長(zhǎng)下難以全面反映，故本研究采用多波長(zhǎng)融合技術(shù)建立大川芎片多波長(zhǎng)融合指紋圖譜，并通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，建立全析指紋圖譜的質(zhì)量控制體系，為大川芎片及中藥制劑質(zhì)量控制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司，包括高壓二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、Agilent 1100 色譜工作站)；HPLC-TOF-MS(美國(guó)安捷倫科技公司)。

1.2試藥天麻素對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110807-201306)；大川芎片(大連富生制藥有限公司，批號(hào)：20120601、20121101、20130301、20130401、20130501、20130901、20131101、20140201、20140301、20140601)。乙腈(色譜試劑，F(xiàn)isher公司，批號(hào)：110906)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110409)；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1大川芎片多波長(zhǎng)融合指紋圖譜

2.1.1色譜條件Aglient TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.04%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0~10 min，2%-2%(B)，10~90 min，2%-24%(B)；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：210、225、254、270、320 nm，進(jìn)樣量：10 μL[1]。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備取天麻素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備取大川芎片適量，去除包衣，研碎，過(guò)40目篩，精密稱(chēng)取樣品粉末2.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加甲醇80 mL回流提取2 h，濾過(guò)，濃縮，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.1.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇及多波長(zhǎng)指紋圖譜融合[2]光譜波長(zhǎng)范圍的選取DAD設(shè)定為200～400 nm全波長(zhǎng)掃描。取供試品溶液，按設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。用所得的三維色譜-光譜數(shù)據(jù)，可知，大川芎片的色譜信號(hào)以紫外光區(qū)為主，大川芎片中的主要成分分別在210、225、254、270、320 nm下有較大吸收，故確定融合波長(zhǎng)為210、225、254、270、320 nm。

分別從 Aglient 1100色譜工作站中導(dǎo)出210、225、254、270、320 nm的dif格式數(shù)據(jù)文件，使用Matlab軟件編程，對(duì)dif格式數(shù)據(jù)進(jìn)行全時(shí)段多波長(zhǎng)融合，得到同時(shí)反映5個(gè)波長(zhǎng)信息的色譜圖和圖譜數(shù)據(jù)，相關(guān)色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.5精密度試驗(yàn)取同一批供試品溶液(批號(hào)：20140301)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜并進(jìn)行多波長(zhǎng)融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<3%，表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批供試品溶液(批號(hào)：20140301)，分別在0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜并進(jìn)行多波長(zhǎng)融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<3%，表明該樣品穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.7重復(fù)性試驗(yàn)分別取同一批號(hào)(批號(hào)：20140301)樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜并進(jìn)行多波長(zhǎng)融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<3%，表明該制備和檢測(cè)方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.2指紋圖譜的建立、參照峰及特征峰的選擇取10批大川芎片制劑，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別取10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，記錄指紋圖譜并進(jìn)行多波長(zhǎng)融合，將10批大川芎片的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)，選擇色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正、色譜峰自動(dòng)匹配后，以中位數(shù)法生成HPLC指紋圖譜共有模式(圖2)。結(jié)果表明10批樣品的指紋圖譜與共有模式的相似度分別為0.958、0.959、0.961、0.952、0.968、0.960、0.948、0.933、0.968、0.962，且相似度均>0.920。對(duì)色譜峰進(jìn)行分析，選擇穩(wěn)定性、重復(fù)性好、特征明顯的色譜峰為共有，共標(biāo)定13個(gè)共有峰(圖3)，共有峰面積占本文所示指紋圖譜總峰面積的90%以上，符合指紋圖譜共有峰的要求。其中峰S經(jīng)對(duì)照品比對(duì)為天麻素色譜峰，該峰峰面積較大，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，因此選擇該峰為指紋圖譜的參照峰。

2.3采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)推斷大川芎片中主要化學(xué)成分

2.3.1樣品制備方法對(duì)照品制備方法見(jiàn)“2.1.2”項(xiàng)下。供試品制備方法見(jiàn)“2.1.3”項(xiàng)下。

2.3.2分析方法

2.3.2.1液相條件的選擇見(jiàn)“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件。

圖1　大川芎片及天麻素對(duì)照品融合前后指紋圖譜 大川芎片：A.210 nm;B.225 nm;C.254 nm;D.270 nm;E.320 nm；F.大川芎片多波長(zhǎng)融合指紋圖譜；G.多波長(zhǎng)融合天麻素對(duì)照品圖譜

圖2　10批大川芎片的多波長(zhǎng)融合指紋圖譜共有模式圖

圖3　大川芎片融合指紋圖譜

2.3.2.2質(zhì)譜條件的選擇電噴霧離子源(Dual ESI)，正、負(fù)離子模式檢測(cè)，干燥氣體流速為10 L·min-1，干燥氣體溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓(Vcap)為3 500 V，霧化器壓力為50 psig，碎裂電壓為110 V，Skimmer 為65 V，OCT IRF Vpp為250 V，m/z范圍為50~2 000。

2.3.3結(jié)果取大川芎片供試品溶液按“2.3.2”項(xiàng)下分析方法進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，應(yīng)用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)和對(duì)照品比對(duì)，對(duì)大川芎片融合指紋圖譜中共有峰初步定性。通過(guò)質(zhì)譜指認(rèn)和對(duì)照品比對(duì)，共初步鑒定了8個(gè)共有峰，結(jié)果見(jiàn)表1[3~8]。

表1　大川芎片主要化學(xué)成分HPLC-MS數(shù)據(jù)及化合物推測(cè)

3討論

大川芎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的指標(biāo)性成分為天麻素，而其來(lái)源于大川芎片中天麻藥材，天麻為名貴中藥材，為避免市場(chǎng)魚(yú)目混珠，故建立多波長(zhǎng)融合指紋圖譜并對(duì)其主成分初步定性分析，建立全面的質(zhì)量控制體系來(lái)控制樣品質(zhì)量，解決實(shí)際生產(chǎn)

問(wèn)題，從而降低檢測(cè)限、克服單一波長(zhǎng)下信息量不足的缺點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)考察水、70%甲醇、甲醇不同溶劑對(duì)樣品的提取，結(jié)果表明不同提取溶媒對(duì)樣品成分存在較大差異，大川芎片中天麻、川芎兩味藥材水溶性極性大的成分較多，其中水、70%甲醇提取樣品色譜峰雜，分離度不好，故采用純甲醇進(jìn)行提取。大川芎片制劑中強(qiáng)極性成分較多并且在低波長(zhǎng)225 nm下吸收較為明顯，故選擇乙腈-水系統(tǒng)初始梯度為98%水相分離效果較好，基線(xiàn)較為平穩(wěn)。

本文通過(guò)多波長(zhǎng)融合技術(shù)手段及HPLC-MS分析方法建立了大川芎片全析指紋圖譜，與傳統(tǒng)的僅以一種化學(xué)成分為參照峰作相對(duì)定量的指紋圖譜相比，該法更能真實(shí)客觀的反映大川芎片的內(nèi)在質(zhì)量，它使得指紋圖譜中獲得的峰得到辨認(rèn)，是一種潛移默化的從相對(duì)定量到絕對(duì)定量的提升，為以后大川芎片及中成藥的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新的參考依據(jù)。

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