劉 譽(yù)，馬袆楠

(北京大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，處于新陳代謝和生物能量轉(zhuǎn)換的中心地位。核DNA和線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)共同編碼呼吸鏈體系與氧化磷酸化過程中的多個(gè)相關(guān)因子，因此mtDNA的完整性對(duì)生物體各器官的正常生理功能具有重要意義。隨著越來越多的mtDNA突變被發(fā)現(xiàn)，線粒體疾病的基因型、臨床癥狀以及診斷治療都得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，尤其是mtDNA的拷貝數(shù)與臨床疾病的關(guān)系日益受到重視。

1 mtDNA拷貝數(shù)的定義

拷貝數(shù)是指某基因在某一生物的基因組中的個(gè)數(shù)。每個(gè)線粒體含有2～10個(gè)mtDNA拷貝數(shù)，每個(gè)細(xì)胞含有10～1000個(gè)線粒體，但不同組織細(xì)胞的線粒體數(shù)目有所差異，每個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)元中線粒體數(shù)目分別為223～854個(gè)、1075～2794 個(gè)和1200～10 800個(gè)[1]。

2 mtDNA拷貝數(shù)及其調(diào)控

2.1 mtDNA的復(fù)制

哺乳動(dòng)物的mtDNA是一個(gè)長(zhǎng)度約為16.5 kb的結(jié)構(gòu)緊密的雙鏈閉合環(huán)狀分子，外環(huán)為重鏈(H鏈)，內(nèi)環(huán)為輕鏈(L鏈)，其mtDNA復(fù)制以D環(huán)復(fù)制方式為主。過去幾十年，人們對(duì)mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)mtDNA重鏈起始位點(diǎn)復(fù)制的開始必須有一個(gè)轉(zhuǎn)錄伴隨的引物RNA結(jié)構(gòu)復(fù)合體的合成，隨后復(fù)制在線粒體DNA聚合酶γ(mitochondrial DNA polymerase γ，mtDNApolγ)、線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白(mitochondrial single-stranded-DNA-binding protein，mtSSB)等因子的作用下進(jìn)行。在RNA引物合成過程中，RNA引物的成熟不僅需要RNA聚合酶(RNA polymerase，RNA pol)，還需要一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子——線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，mtTFA)的參與[2]。

2.2 mtDNA復(fù)制的調(diào)控

2.2.1 mtTFA mtTFA是由核基因編碼的線粒體核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，屬于高遷移率(high mobility group，HMG)蛋白家族，含有兩個(gè)HMG盒(box)結(jié)構(gòu)域[3]。線粒體啟動(dòng)子的起始由mtTFA的量調(diào)節(jié)，mtTFA通過結(jié)合在mtDNA輕、重鏈啟動(dòng)子的上游來促進(jìn)mtDNA的轉(zhuǎn)錄[4]。mtTFA介導(dǎo)mtDNA含量增加的可能機(jī)制有兩種：(1)mtTFA較高頻率地結(jié)合于輕鏈啟動(dòng)子，提升轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的復(fù)制啟始；(2)mtTFA結(jié)合全基因組，可能通過降低DNA的更新速率以穩(wěn)定mtDNA的穩(wěn)態(tài)水平。亦有學(xué)者認(rèn)為[5]，mtTFA大量且非特異地結(jié)合線粒體基因組，形成DNA環(huán)，引起超螺旋化，散在分布的點(diǎn)狀蛋白-DNA結(jié)構(gòu)形成類核。類核是線粒體基因組的功能單位，保證mtDNA免受多種損害。研究發(fā)現(xiàn)，mtTFA結(jié)合mtDNA，可對(duì)抗人β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42 對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞氧化呼吸鏈的損傷，原因可能是mtTFA過表達(dá)可維護(hù)線粒體類核結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)mtDNA拷貝數(shù)，從而改變細(xì)胞生存能力，降低細(xì)胞凋亡率，可見mtTFA可能與通過類核結(jié)構(gòu)保護(hù)mtDNA免受氧化損傷有關(guān)，從而調(diào)控mtDNA拷貝數(shù)[6]。

2.2.2 mtDNApolγ mtDNApolγ是所有DNA聚合酶中唯一位于線粒體并參與mtDNA復(fù)制及修復(fù)的酶。mtDNApolγ由一個(gè)催化亞基(polγA)和兩個(gè)附屬亞基(polγB)組成，分別由不同的核基因編碼。mtDNApolγ對(duì)mtDNA的調(diào)控在一定程度上受核DNA甲基化的影響，編碼mtDNApolγ的核基因CpG島上外顯子2高度甲基化，影響該CpG島下游的延伸及mtDNApolγ的前體mRNA選擇性剪切和激活，抑制mRNA表達(dá)水平，從而影響mtDNA復(fù)制[7]。越來越多的研究表明，盡管人類線粒體疾病是由線粒體基因突變及線粒體DNA編碼蛋白功能異常引起，但線粒體疾病的突變位點(diǎn)更多位于常染色體上，且由mtDNApolγ引起的突變最為常見[8]。其中研究最為深入的A467T突變可導(dǎo)致mtDNApolγ催化亞基的催化活性和DNA結(jié)合能力嚴(yán)重下降，并影響其與附屬亞基的相互作用，從而使人類mtDNA不能正常合成，引起阿爾珀斯-胡滕洛邇綜合征(Alpers-Huttenlocher syndrome，AHS)等線粒體疾病[9]。

2.2.3 mtSSB mtSSB在mtDNA復(fù)制起始以及鏈延伸過程中發(fā)揮重要作用。真核生物的mtSSB是一個(gè)13～18 ku的保守因子。研究發(fā)現(xiàn)，隨著mtSSB有助于模板DNA的解鏈，復(fù)制過程中，mtSSB與中間體——單鏈線粒體DNA結(jié)合，以防止單鏈DNA再次復(fù)性或被DNA酶降解。同時(shí)mtSSB還可以促進(jìn)mtDNApolγ的活性，保證mtDNA復(fù)制鏈正常延伸。mtSSB對(duì)mtDNApolγ的刺激作用隨濃度變化，即低濃度的mtSSB對(duì)mtDNApolγ無作用，而閾值濃度刺激作用增強(qiáng)[10]。此外，mtSSB還可增強(qiáng)引物與模板DNA的識(shí)別，可提高mtDNA復(fù)制起始速率近30倍。故mtSSB對(duì)mtDNA復(fù)制起始階段mtDNApolγ-模板-引物這一復(fù)合物的形成必不可少，且可增強(qiáng)復(fù)合物的穩(wěn)定性[11]。

3 mtDNA拷貝數(shù)與疾病

3.1 mtDNA拷貝數(shù)與線粒體DNA耗竭綜合征

線粒體DNA耗竭綜合征(mitochondrial DNA depletion syndrome，MDS)是一種由核基因突變引起的常染色體隱性病，是由mtDNA拷貝數(shù)下降或缺失導(dǎo)致特異性器官或組織的線粒體氧化呼吸功能受損、能量生成障礙，進(jìn)而引起的一系列臨床癥狀的總稱。根據(jù)臨床癥狀，MDS可分為4個(gè)亞組：肝腦型、肌型、腦肌病型和神經(jīng)胃腸道型[12]。MDS常常涉及突變的基因，包括TK2，SUCLA2，SUCLG1，RRM2B，DGUOK，MPV17，TYMP和POLG1，其中POLG1基因突變備受關(guān)注。POLG1基因位于15q24，編碼唯一參與mtDNA復(fù)制和修復(fù)的mtDNApolγ。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有45個(gè)不同的POLG基因點(diǎn)突變和片段缺失都可引起AHS，467A>T和243G>C是POLG1突變引起AHS最常見的兩個(gè)突變位點(diǎn)[13]。典型的AHS患者在幼年時(shí)期常表現(xiàn)為難治性癲癇、神經(jīng)退行性病變和肝臟疾病。另一些AHS患者則出現(xiàn)精神萎靡、難治性癲癇、卒中樣發(fā)作、肝臟病變及共濟(jì)失調(diào)等癥狀，更有AHS患者表現(xiàn)為低血糖癥、血乳酸升高和肝衰竭。這類患者通常在嬰兒時(shí)期出現(xiàn)癥狀，且病情較重，生存率低[14]。

脫氧鳥苷酸激酶(deoxyguanosine kinase，DGUOK)缺失為常染色體隱性致病，臨床癥狀分為肝腦型MDS和孤立性肝損害兩種形式。DGUOK位于2p13，編碼DGUOK[12]，其可催化脫氧核糖核苷酸嘌呤堿基的磷酸化作用。其中一個(gè)引起MDS的DGUOK點(diǎn)突變?yōu)槲挥?號(hào)外顯子313C>T，突變后形成終止密碼。其他突變還包括34C>T，3G>A，494A>T倒位，766-767insGATT插入444-62C>A插入[15]。而引起孤立性肝損害的DGUOK基因突變主要有137A>G和797T>G[16]。肝腦型MDS患者通常出現(xiàn)發(fā)育遲緩、頭小畸形、肌張力下降、肝脾腫大、黃疸或膽道閉鎖等；而孤立性肝損害患者最終可演變?yōu)槟I功能不全[14]。

核基因MPV17位于2p23-21，編碼線粒體內(nèi)膜的通道蛋白，MPV17突變是引起肝腦型MDS最主要的原因。盡管有個(gè)別報(bào)道在成年人中檢測(cè)出MPV17基因突變，但大部分患者都是新生兒和兒童，肝、腦受損是最明顯的臨床表現(xiàn)[17]。幾乎所有患者都有肝功能不全癥狀、膽道閉鎖、黃疸和凝血功能障礙，此外，喂養(yǎng)困難、低血糖、血乳酸升高、肌張力下降和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩也是常見表現(xiàn)[18]。

3.2 mtDNA拷貝數(shù)與臨床相關(guān)疾病

3.2.1 mtDNA拷貝數(shù)與糖尿病 糖尿病性視網(wǎng)膜病變大鼠病程初期，線粒體損傷防御機(jī)制活躍，mtTFA、D-環(huán)區(qū)mtDNA-mtTFA復(fù)合物、mtDNApolγ及mtDNA拷貝數(shù)升高。隨病程進(jìn)展，mtDNA功能受損，mtTFA、mtDNA-mtTFA復(fù)合物減少，mtDNA拷貝數(shù)下降[19]。Nile等[20]通過建立MIN6細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，在沉默mtTFA后誘導(dǎo)生成的細(xì)胞中，mtDNA拷貝數(shù)下降40%，mtDNA拷貝數(shù)下降影響線粒體呼吸氧化功能和ATP生成，胰島素分泌功能嚴(yán)重受損。

3.2.2 mtDNA拷貝數(shù)與心血管疾病 已有文獻(xiàn)報(bào)道[21]，心力衰竭患者的心肌細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)明顯下降，氧化應(yīng)激加重心力衰竭和心肌重塑，而線粒體內(nèi)電子傳遞鏈正是氧化自由基的重要來源。在心肌梗死小鼠體內(nèi)，過表達(dá)抗氧化基因過氧化物氧還酶(peroxiredoxin)-3(Prx-3)和mtTFA可在一定程度上提高心力衰竭患者的mtDNA拷貝數(shù)，延緩病理性心肌重塑，提高小鼠生存率。Ikeda等[22]發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)mtTFA和Twinkle解螺旋蛋白(由位于常染色體10q24的C10orf2/PEO1基因編碼，參與mtDNA復(fù)制過程的解螺旋過程)的小鼠中，mtDNA拷貝數(shù)增加2倍，且減輕了離心性心肌肥大中的心肌損傷。因此，增加mtDNA拷貝數(shù)成為治療氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心肌損傷的新途徑。

3.2.3 mtDNA拷貝數(shù)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病 mtTFA過表達(dá)能抑制Aβ引起的呼吸鏈活性降低、ATP和細(xì)胞色素C氧化酶含量減少，保護(hù)mtDNA免受Aβ的毒性作用。在亨廷頓病(Huntington disease，HD)發(fā)病機(jī)制中，過氧化體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)受損引起的線粒體功能障礙受到重視，mtTFA是PGC-1α通過下游調(diào)控因子和核呼吸因子(nuclear respiratory factor-1，NRF-1)調(diào)節(jié)線粒體功能的最重要靶點(diǎn)之一。在HD轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉、紋狀體和HD患者的肌肉活檢中，均觀察到明顯的PGC-1α表達(dá)下降及相應(yīng)的NRF-1和mtTFA表達(dá)下降。

3.2.4 mtDNA拷貝數(shù)與腫瘤 線粒體對(duì)許多致癌因素敏感，mtDNA拷貝數(shù)的變化與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。Sun等[23]通過檢測(cè)139名子宮內(nèi)膜癌患者外周血發(fā)現(xiàn)，其mtDNA拷貝數(shù)明顯高于對(duì)照組，在患子宮內(nèi)膜癌的高危因素中，高血壓、糖尿病和肥胖也與細(xì)胞中mtDNA的低拷貝數(shù)密切相關(guān)。據(jù)Melkonian等[24]報(bào)道，細(xì)胞中mtDNA低拷貝數(shù)增加腎細(xì)胞腎癌的發(fā)生率，尤其在女性、年齡<60歲以及有高血壓病史的患者中相關(guān)性更強(qiáng)。mtDNA拷貝數(shù)與某些腫瘤分化程度成反比。過去認(rèn)為乳腺癌患者mtDNA拷貝數(shù)減少，但Xia等[25]發(fā)現(xiàn)Ⅰ期乳腺癌患者mtDNA拷貝數(shù)呈低水平，而Ⅱ～Ⅳ期患者則增高，這可能與mtDNA受活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)不斷攻擊、復(fù)制增強(qiáng)以及代償能量需求有關(guān)。

3.3 mtDNA拷貝數(shù)與線粒體A3243G突變

細(xì)胞中野生型mtDNA拷貝數(shù)含量與線粒體的氧化功能密切相關(guān)，Liu等[26]通過檢測(cè)115名帶有線粒體A3243G點(diǎn)突變患者的外周血細(xì)胞和尿液細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，尿液細(xì)胞中野生型mtDNA拷貝數(shù)與疾病復(fù)雜程度呈負(fù)相關(guān)，即野生型mtDNA拷貝數(shù)越多，患者臨床癥狀越單一、病情越輕；隨著患者的臨床表型(如癲癇、智力低下、卒中、肌無力、頭痛等)復(fù)雜程度加重，血液及尿液的野生型拷貝數(shù)逐漸減少，而突變比例逐漸增加，但聽力下降和糖尿病的發(fā)病率卻是降低的。除此之外，尿液中和血液中突變型mtDNA拷貝數(shù)也是判斷A3243G患者疾病復(fù)雜程度的重要指標(biāo)。這一發(fā)現(xiàn)表明，線粒體拷貝數(shù)變異為揭示線粒體疾病的臨床表型差異奠定了基礎(chǔ)。

4 治療與藥物

對(duì)于線粒體疾病，至今尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法，臨床上一般采用藥物或支持性療法來緩解患者的癥狀，如補(bǔ)充維生素、改善營(yíng)養(yǎng)、治療癲癇發(fā)作、調(diào)節(jié)血乳酸水平、外科矯正上瞼下垂癥等。目前，臨床上針對(duì)A3243G突變引起的乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作的線粒體腦肌病多采用雞尾酒療法，即聯(lián)合應(yīng)用多種抗氧化劑和維生素及輔因子。

綜上所述，線粒體轉(zhuǎn)錄因子作為線粒體轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的重要調(diào)節(jié)子，mtTFA的缺失可導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)的減少和嚴(yán)重的呼吸鏈缺陷，mtTFA的過表達(dá)可顯著改善線粒體的功能缺陷，進(jìn)而起到緩解疾病的作用。進(jìn)一步了解mtTFA在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控對(duì)于線粒體疾病的治療有重要意義。mtTFA的多態(tài)性不僅與疾病相關(guān)，還與個(gè)體的體能和壽命相關(guān)，因此，mtTFA可作為疾病治療和改善機(jī)體功能的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

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