胡春梅 郭晶 嚴虹 施旭東 張俠

?

·論著·

熒光定量PCR探針熔解曲線法在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應(yīng)用

胡春梅 郭晶 嚴虹 施旭東 張俠

目的 應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測耐多藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株對一線抗結(jié)核藥物的耐藥基因突變。方法 于2009年1月1日至2012年12月31日留取南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科門診部或住院的所有肺結(jié)核患者痰液標本，每人3～5 ml，均進行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，分離出結(jié)核分枝桿菌菌株67株。應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法，根據(jù)靶序列熔點變化，實時PCR檢測結(jié)核病患者的臨床分離標本對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥情況；通過與傳統(tǒng)藥敏試驗進行對比，對2種結(jié)果不一致的菌株進行基因測序分析，探討其發(fā)生突變的位點差異，并觀察在治療中的變化。結(jié)果 利福平和異煙肼的表型和基因型檢測具有較高的一致性，分別為99%(66/67)和97%(65/67)，不一致的菌株都是表型檢測法為耐藥，而基因型檢測為敏感，測序未檢測到突變。乙胺丁醇和鏈霉素的表型和基因型檢測一致性較低，分別為60%(40/67)和75%(50/67)。測序發(fā)現(xiàn)，乙胺丁醇的突變發(fā)生在embB306和embB406位點上；鏈霉素突變發(fā)生在rrs基因517位點和907位點，以及rpsL43耐藥密碼子。結(jié)論 應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法，能快速篩查結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況。

探針熔解曲線法； 結(jié)核，肺； 抗藥性，多種，細菌； 耐藥基因； 突變

耐多藥結(jié)核病是結(jié)核病治療中的重點和難點，開展結(jié)核分枝桿菌耐藥性的動態(tài)監(jiān)測，是結(jié)核病控制工作的一項重要內(nèi)容，也是制訂抗結(jié)核化療方案的重要依據(jù)。筆者曾對耐多藥肺結(jié)核患者在治療中的不同時間點，動態(tài)監(jiān)測其結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)有獲得耐藥性及恢復(fù)敏感性的現(xiàn)象發(fā)生，其中異煙肼和利福平表現(xiàn)為高度耐藥性且穩(wěn)定，乙胺丁醇和左氧氟沙星表現(xiàn)為高獲得性耐藥[1-2]。結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，是目前檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的金標準，但由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，很難達到快速檢測的要求，具有一定局限性[3]?；蛐湍退帣z測，通過檢測結(jié)核分枝桿菌特定基因組區(qū)域的突變來預(yù)測耐藥，因其耗時短，能較快地指導(dǎo)臨床用藥，逐漸成為結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測的趨勢[4]。但有文獻報道，在臨床應(yīng)用中基因型耐藥檢測與表型耐藥檢測存在不一致[5-6]。因此，本研究設(shè)想應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測耐多藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥基因突變，并與傳統(tǒng)藥敏試驗法進行對比，衡量基因型檢測的一致性；對不一致性的菌株進行基因測序，探尋是否有新的突變位點，觀察耐多藥肺結(jié)核患者的耐多藥菌株在抗結(jié)核治療過程中，對一線抗結(jié)核藥物表型和基因型耐藥性的動態(tài)變化，為耐多藥肺結(jié)核治療方案的調(diào)整提供參考。

材料和方法

一、菌株來源

于2009年1月1日至2012年12月31日，留取南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科門診部或住院的所有肺結(jié)核患者的痰液標本3～5 ml，均進行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗。

野生型菌株為國家結(jié)核病參比實驗室提供的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株。

二、 方法

1.痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定及藥敏試驗：按WHO和全國結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證要求[8-11]，進行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定，證實為結(jié)核分枝桿菌。用絕對濃度法[9]進行4種一線抗結(jié)核藥物耐藥性的檢測。各藥物均設(shè)高低2個濃度，試驗濃度分別為：Sm(10，100) μg/ml，INH(1，10) μg/ml，EMB (5，50) μg/ml，RFP(25，250) μg/ml。以對照管生長，含藥高、低濃度管均不生長為敏感；含藥低濃度管生長、高濃度管不生長為中度耐藥；含藥高、低濃度管均生長為高度耐藥。本研究所指的耐藥包括中度耐藥和高度耐藥。其中用H37Rv標準株進行常規(guī)質(zhì)量控制，同時運用比例法與絕對濃度法進行對比試驗，以此對絕對濃度法進行質(zhì)量控制。

2.耐多藥結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)基因突變的檢測：對67株待檢測的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株進行復(fù)活、接種、滅活，采用煮沸法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA(經(jīng)紫外定量，要求結(jié)核分枝桿菌含量不低于103拷貝/μl)進行加樣。同時設(shè)立陰性(無菌雙蒸水)和陽性對照品(H37Rv菌株)DNA各5 μl，用CFX96實時熒光PCR擴增儀(美國，伯樂公司)進行擴增。應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法(耐藥突變檢測試劑盒，廈門致善生物科技有限公司)檢測結(jié)核分枝桿菌菌株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的突變，進行耐藥篩選，用于獲得結(jié)核分枝桿菌對4種藥的耐藥信息。其中，利福平檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp，利福平耐藥決定區(qū))的突變。異煙肼檢測ahpC啟動子區(qū)(-44～-30以及 -15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點)及katG315密碼子的突變，具體可檢測的耐藥突變位點包括ahpC啟動子 -44A、-42C、-39T、-34C、-32A、-30T、-15T、-12T、-10A、-10G、-10T、-9A、-6A、-4G，ahpC4T，inhA94GCG，inhA啟動子 -17T、-16G、-15T、-11T、-8A、-8C，katG315AGG、katG315CGC、katG315CTC、katG315ACC、katG315AAC、katG315ATC、katG315ACA。乙胺丁醇檢測embB306、embB497、embB368、embB378、embB380和embB406位密碼子是否突變。鏈霉素檢測結(jié)核分枝桿菌rpsL基因43位密碼子和88位密碼子，以及rrs基因513～517位點和905～908位點的突變。

采用梯度稀釋的野生型標準株H37Rv DNA考察探針熔解曲線分析法的分析敏感度，然后用標準盤驗證其檢測特異度。對熔解曲線法與傳統(tǒng)藥敏試驗檢測結(jié)果不一致的樣本進行測序。

三、統(tǒng)計學分析

本試驗用Chromas 2軟件分析測序結(jié)果，用Clustalx軟件比對是否突變，將整理后的突變數(shù)據(jù)和耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株藥敏試驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，同一菌株的突變數(shù)據(jù)和耐藥數(shù)據(jù)相互對應(yīng)。

結(jié) 果

一、菌株的提取

參照中國防癆協(xié)會[7]《耐藥結(jié)核病化學治療指南》，制定抗結(jié)核治療方案為6 Am(Cm)、Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z/18Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z，治療共24個月，每3個月進行1次痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。統(tǒng)計治療期間痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性2次以上(包括治療前)的耐多藥肺結(jié)核患者，共14例。其中男7例，女7例，年齡(35.0±9.0)歲，共獲得結(jié)核分枝桿菌菌株67株，-70 ℃冷凍保存在南京市胸科醫(yī)院中心實驗室菌株庫，進行治療前后4種常用抗結(jié)核藥物表型和基因型耐藥檢測的對比分析。

二、耐藥表型及基因型檢測的一致性

結(jié)核分枝桿菌菌株對4種抗結(jié)核藥物耐藥的表型及基因型檢測的一致性分別為：利福平99%(66/67)、異煙肼97%(65/67)、乙胺丁醇60%(40/67)、鏈霉素75%(50/67)。

三、耐藥表型及基因型檢測不一致的菌株分析

用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥，與藥敏試驗法結(jié)果不一致的菌株分別僅為1株、2株，都是表型檢測法為耐藥，而基因型檢測為敏感。對不一致菌株進行了測序，未檢測到突變。對乙胺丁醇耐藥檢測，2種方法不一致的菌株為27株，其中乙胺丁醇表型檢測法為耐藥，而基因型檢測為敏感有14株，對14株測序，相應(yīng)檢測位點峰型為單峰，未檢測到突變。對乙胺丁醇表型檢測敏感但基因型檢測耐藥的有13株，有10株樣本的突變發(fā)生在embB306位點上，其中有7株出現(xiàn)ATG→GTG突變，1株為ATG→CTG突變，1株為ATG→ATT突變，1株為ATG→ATA突變；有3株樣本的突變發(fā)生在embB406位點上，出現(xiàn)GGC→GCC突變。對鏈霉素耐藥檢測，2種方法不一致的菌株有17株菌株。其中6株表型檢測法結(jié)果為耐藥，而基因型檢測法結(jié)果為敏感，測序未檢測到突變；而11株表型檢測法為敏感，而基因型檢測法結(jié)果為耐藥，對其測序發(fā)現(xiàn)，有9株發(fā)生rrs基因517位點的C→T突變，1株發(fā)生rrs基因907位點的A→T突變，1株發(fā)生rpsL43耐藥密碼子的AAG→AGG突變。

四、菌株耐藥的動態(tài)變化

14例耐多藥結(jié)核病患者的67株菌株對利福平、異煙肼表型耐藥穩(wěn)定，沒有動態(tài)改變，呈持續(xù)耐藥；基因型耐藥檢測顯示也相對穩(wěn)定，僅有1例患者的結(jié)核分枝桿菌菌株發(fā)生動態(tài)變化，該例患者的結(jié)核分枝桿菌菌株在治療前基因型檢測是耐藥，而治療后基因型檢測是1株對利福平、2株對異煙肼敏感但無突變。然而對乙胺丁醇、鏈霉素的表型和基因型耐藥檢測提示均不穩(wěn)定，其耐藥性可能會發(fā)生改變。其中乙胺丁醇表型檢測顯示：1例患者出現(xiàn)復(fù)敏，1例出現(xiàn)繼發(fā)耐藥，1例出現(xiàn)復(fù)敏后再次繼發(fā)耐藥；基因型檢測有1例發(fā)生動態(tài)變化，從耐藥基因有突變到無突變又再次突變。鏈霉素的表型耐藥檢測2例出現(xiàn)繼發(fā)耐藥，1例出現(xiàn)復(fù)敏；基因型檢測發(fā)現(xiàn)有3例發(fā)生動態(tài)變化，其中2例耐藥基因從無突變到突變。

五、菌株發(fā)生耐藥動態(tài)變化的臨床病例分析

在治療過程中，14例耐多藥結(jié)核病患者的耐藥基因發(fā)生動態(tài)變化，主要集中在3例患者的38株。臨床共同特點是：復(fù)治多年、肺部病灶廣泛(病灶范圍≥3個肺葉)、伴有1個以上空洞或肺葉毀損。臨床治療方案是：對氨基水楊酸異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星或莫西沙星、阿米卡星靜脈滴注6個月。

討 論

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)造成結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機制與基因突變有關(guān)。不同的基因突變使感染人體的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同的藥物耐受性。實時熒光PCR技術(shù)將擴增和檢測兩步驟合一，具有實時擴增實時檢測、高效、快捷、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點，可以同時對結(jié)核分枝桿菌耐藥多個相關(guān)基因突變同時進行檢測，特別適用于大批量篩查[12-15]。

因此，筆者應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法，根據(jù)靶序列熔點變化，實時PCR檢測結(jié)核分枝桿菌基因組中的耐藥相關(guān)突變位點變化，以分析耐藥情況。對67株耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株進行4種一線抗結(jié)核藥物耐藥基因型檢測，和傳統(tǒng)的表型檢測金標準相比較，結(jié)果表明利福平和異煙肼的表型和基因型檢測具有較高的一致性，分別達99%和97%，而乙胺丁醇和鏈霉素的表型和基因型檢測一致性相對偏低。對2種檢測方法不一致的菌株進行乙胺丁醇和鏈霉素的基因測序，進一步探索其他基因或基因區(qū)引起的突變，發(fā)現(xiàn)對藥敏試驗結(jié)果為耐藥但用熒光定量PCR探針熔解曲線法結(jié)果為敏感的菌株進行基因測序，未檢測到基因突變；對藥敏試驗結(jié)果為敏感但用熒光定量PCR探針熔解曲線法結(jié)果為耐藥的菌株進行基因測序，乙胺丁醇存在embB306、406基因位點突變，鏈霉素存在rrs基因517、907位點和rpsL43耐藥密碼子的點突變，這些突變位點均是既往已經(jīng)報道過的[16-17]，沒有發(fā)現(xiàn)新的基因突變位點。

分析2種檢測方法不一致的原因可能如下：(1)耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株對乙胺丁醇和鏈霉素的表型耐藥動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)：存在不穩(wěn)定性，可能會發(fā)生動態(tài)變化[1-2]。(2)表型檢測試驗結(jié)果雖然是當前檢測耐藥的金標準，但仍存在局限性；(3)本試驗的耐藥突變檢測，只篩選核酸序列而不是氨基酸序列。因此，有可能不引起氨基酸改變的突變(沉默突變)也會被判為突變型。(4)如檢測樣品出現(xiàn)不均一耐藥菌株，耐藥菌株的比例偏低，需要結(jié)合熔解曲線峰型具體判斷突變比例，有可能出現(xiàn)假陰性，而判定為敏感無突變。(5)可能是與新的耐藥機制有關(guān)，如已知耐藥基因以外的其他基因突變和外排泵機制等，也可能存在異質(zhì)性耐藥或外源性再感染、混合感染以及藥敏試驗結(jié)果誤差等[5-6,18]，仍需要擴大基因庫及進一步研究。

另外，對耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株在治療過程中對4種抗結(jié)核藥物的耐藥性的動態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)，不管用表型還是基因型檢測，利福平和異煙肼的耐藥性都很少發(fā)生改變；但是乙胺丁醇和鏈霉素均顯示相對不穩(wěn)定，說明在治療過程中對乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥性可能會發(fā)生改變。因此，在臨床治療過程中，筆者建議要對乙胺丁醇和鏈霉素進行動態(tài)的耐藥檢測，以便及時調(diào)整治療方案。

總之，本研究用熒光定量PCR探針熔解曲線法，實時檢測結(jié)核分枝桿菌基因組中的耐一線抗結(jié)核藥相關(guān)突變位點變化，以判斷是否耐藥；并和傳統(tǒng)的藥敏試驗結(jié)果檢測進行對比，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌株對利福平、異煙肼的基因檢測與藥敏試驗結(jié)果、測序結(jié)果具有較高的一致性。對不一致的菌株再次進行基因測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測為敏感的菌株未檢測到基因突變；而用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測為耐藥的菌株確實存在基因位點突變，但突變位點均是已經(jīng)報道過的，在待檢的菌株中沒有發(fā)現(xiàn)新的基因突變位點。耐藥基因檢測的優(yōu)勢在于快速了解耐藥基因位點突變，篩查耐多藥肺結(jié)核，并在治療中進行動態(tài)監(jiān)測，及時了解患者耐藥信息和突變位點的變化，精確尋找到耐藥的原因并指導(dǎo)調(diào)整有效的治療方案，為精準個體化醫(yī)療奠定基礎(chǔ)，有利于結(jié)核病的控制和阻斷耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播，具有較大的社會經(jīng)濟效益，值得臨床推廣。然而，本研究只檢測了67份藥敏試驗結(jié)果證實的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株標本，樣本量偏少，且沒有檢測敏感結(jié)核分枝桿菌菌株、明確有無外源性再感染、混合感染或異質(zhì)性耐藥等，還存在一定局限性。

[1] 張俠，胡春梅，王生偉，等. 耐藥肺結(jié)核194例的耐藥譜變化. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33(2)：145-146.

[2] 胡春梅，張俠，李敏, 等.165例耐多藥肺結(jié)核病人治療前后耐藥譜的變化分析.臨床肺科雜志，2009，14(12)：1620-1621.

[3] World Health Organization．Treatment of tuberculosis：guidelines．Geneva： World Health Organization，2010．

[4] 朱長太，胡忠義．結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測技術(shù)進展．中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，34(10)：768-770．

[5] Maruri F，Sterling TR，Kaiga AW，et al．A systematic review of gyrase mutations associated with fluoroquinolone-ResistantMycobacteriumtuberculosisand a proposed gyrase numbering system ．J Antimicrob Chemother，2012，67(4)：819-831．

[6] Hofmann-Thiel S,van Ingen J,Feldmann K,et al．Mechanisms of hetero-resistance to isoniazid and rifampin ofMycobacteriumtuberculosisin Tashkent，Uzbekistan.Eur Respir J，2009，33(2)：368-374．

[7] 中國防癆協(xié)會. 耐藥結(jié)核病化學治療指南(2015). 中國防癆雜志, 2015, 37(5):421-469.

[8] 施旭東，劉正華，吳曉淵，等. 分枝桿菌菌種快速熒光初步鑒定方法的研究.中國防癆雜志, 2004, 26(5):295-297.

[9] 趙雁林，王黎霞，成詩明，等. 結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2013:29-35.

[10] 中國防癆協(xié)會. 結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程. 中國防癆雜志,1996,18(1): 28-31．

[11] World Health Organization. Global Working Group on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance. Guideline for surveillance of drug resistance in tuberculosis.Geneva： World Health Organization，1997．

[12] García de Viedma D, del Sol Díaz Infantes M, Lasala F, et al.New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations inMycobacteriurmtuberculosis．J Clin Microbiol,2002,40(3)：988-995．

[13] Bainomugisa A, Wampande E, Muchwa C, et al. Use of real time polymerase chain reaction for detection ofM.tuberculosis,M.aviumandM.kansasiifrom clinical specimens. BMC Infect Dis,2015, 15:181.

[14] Wang HY, Kim H, Kim S, et al. Performance of a real-time PCR assay for the rapid identification of Mycobacterium species. J Microbiol,2015, 53(1):38-46.

[15] Hu S, Li G, Li H, et al.Rapid detection of isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates by use of real-time-PCR-based melting curve analysis.J Clin Microbiol,2014, 52(5):1644-1652.

[16] Hillemann D, Ru¨sch-Gerdes S, Richter E. Feasibility of the genotype MTBDRsl assay for fluoroquinolone, amikacin-capreomycin, and ethambutol resistance testing ofMycobacteriumtuberculosisstrains and clinical specimens. J Clinic Microbiol，2009,47(6):1767-1772．

[17] Cuevas-Córdobaa B, Cuellar-Sánchezc A, Pasissi-Crivellic A, et al.rrsandrpsLmutations in streptomycin-resistant isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom Mexico. J Microbiol Immuno and Infect, 2013,46(1):30-34.

[18] da Silva PE,Von Groll A,Martin A,et al．Efflux as a mechanism for drug resistance inMycobacteriumtuberculosis．FEMS Immunol Med Microbiol,2011,63(1)：1-9.

(本文編輯：王然 李敬文)

Fluorescence quantitative PCR probe melting curve method in detection of drug resistance genes in

MycobacteriumtuberculosisHUChun-mei,GUOJing,YANHong,SHIXu-dong,ZHANGXia.

DepartmentofTuberculosis,NanjingChestHospital,Jiangsu，Nanjing210029，China

s:ZHANGXia,Email:zhangxia365@sina.com

Objective By fluorescence quantitative PCR probe melting curve method, to detect the resistance mutations of multidrug-resistant tuberculosis clinical isolates to first-line anti-tuberculosis drug, and to provide re-ference for multidrug-resistant tuberculosis treatment. Methods Collecting sputum of all TB patients visiting Nanjing chest hospital between January 1, 2009 and December 31, 2012, 3-5 ml per person, did culture and identification ofMycobacteriumtuberculosisand drug sensitivity test. Sixty seven strains ofMycobacteriumtuberculosiswere isolated. According to the target sequence changes in melting point, to test Rifampicin, Isoniazid, Ethambutol, and Streptomycin resistance by fluorescence quantitative PCR probe melting curve method. By comparison with the conventional susceptibility testing, to analyze the inconsistency of strain genome sequencing of 2 kinds of methods and explore the site differences in mutation, and observe the changes in treatment. Results The phenotypic and genotypic characteristics of the strains resisting to Rifampicin and Isoniazid had a high consistency, which was 99% (66/67) and 97% (65/67), respectively. Testing different strains were phenotypic resistance but genotypic sensitive, which was not detected by sequencing mutation. However, the consistency between the phenotype and genotype of anti-ethambutol and streptomycin strains was 60% (40/67) and 75% (50/67), respectively. Sequencing found Ethambutol mutation occurred in theembB306 andembB406 sites. Streptomycin gene mutations occurred inrrs517,rrs907 andrpsL43. Conclusion The application of the fluorescence quantitative PCR probe melting curve can rapidly screenMycobacteriumtuberculosisdrug resistance to first-line anti-tuberculosis drugs.

Probe melting curve method； Tuberculosis, pulmonary; Drug resistance, multiple, bacterial; Genetic mutations; Genotype analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.01.009

南京市醫(yī)學科技發(fā)展重點項目(ZKX12035)

210029 江蘇省南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科(胡春梅、郭晶、張俠)，檢驗科(嚴虹、施旭東)

張俠，Email：zhangxia365@sina.com

2015-06-15)