潘旭東　毛燕青　陳思文　王　翎　張光波

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院博習(xí)診療中心，江蘇　蘇州　215031)

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Treg和Th17細(xì)胞在老年原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌患者外周血中的失衡表達(dá)及臨床意義

潘旭東毛燕青陳思文王翎張光波1

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院博習(xí)診療中心，江蘇蘇州215031)

摘要〔〕目的探討外周血中Treg、Th17的表達(dá)與老年原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法應(yīng)用四色免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)對65例老年NSCLC患者(老年肺癌組)外周血中Treg、Th17的表達(dá)量進(jìn)行檢測，并分別與老年良性病變組(老年非癌組)、老年健康組以及年輕健康組對比，并研究其與老年肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果老年肺癌組Treg、Th17的表達(dá)量顯著高于其余各組(P<0.05)，兩者在老年非癌組中表達(dá)與老年健康組比較差異均不顯著(P>0.05)；老年健康組Treg的表達(dá)量顯著高于年輕健康組(P<0.05)，而Th17的表達(dá)量在老年健康組與年輕健康組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩者表達(dá)水平與老年肺癌的臨床TNM分期、細(xì)胞分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，而與病理類型無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論Treg、Th17細(xì)胞的失衡表達(dá)在老年原發(fā)性NSCLC的形成和演變過程中發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕非小細(xì)胞肺癌；Treg細(xì)胞；Th17細(xì)胞

1江蘇省臨床免疫研究所

第一作者：潘旭東(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事老年肺癌及免疫衰老的基礎(chǔ)與臨床研究。

研究表明，免疫系統(tǒng)在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但相關(guān)機(jī)制仍不十分明確。細(xì)胞免疫是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要方式，T細(xì)胞又在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著核心作用，有關(guān)CD8+T細(xì)胞識別和清除腫瘤細(xì)胞的作用目前已達(dá)共識，而CD4+T細(xì)胞在腫瘤免疫中尚未得到充分認(rèn)識〔1〕。Treg是具有免疫抑制功能的一群T細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫平穩(wěn)、免疫耐受方面起著重要作用。促炎性Th17和抑制性Treg的平衡有利于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持，失衡可引起局部或全身免疫應(yīng)答異常，對炎癥性疾病、自身免疫病、移植排斥反應(yīng)等均產(chǎn)生重要影響〔2～4〕，但這種失衡是否也在腫瘤免疫中存在目前相關(guān)報道甚少。本文旨在探討外周血中Treg、Th17細(xì)胞的表達(dá)失衡與老年人肺癌的內(nèi)在聯(lián)系及可能機(jī)制。

1對象和方法

1.1研究對象初次入院未經(jīng)治療的老年(≥60歲)原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者(老年肺癌組)65例，其中男45例，女20例，年齡60～80〔平均(67.4±5.3)〕歲，均經(jīng)手術(shù)、氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)病理確診，其中鱗癌28例，腺癌25例，大細(xì)胞癌9例，腺鱗混合癌3例；按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)臨床TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期23例，Ⅳ期16例；另設(shè)同期對照組三組，其中老年良性病變組(老年非癌組)30例，男21例，女9例，為肺部感染、錯鉤瘤以及炎性假瘤患者，年齡60～79〔平均(67.98±6.25)〕歲；老年健康體檢者(老年健康組)30例，男18例，女12例，年齡61～80〔平均(68.6±4.9)〕歲；年輕健康體檢者(年輕健康組)30例，男16例，女14例，年齡28～51〔平均(39.4±9.0)〕歲。所有參與對象均無感染、糖尿病或自身免疫性疾病，也未使用任何影響免疫系統(tǒng)功能的藥物。

1.2研究方法所有患者均于住院后次日晨空腹采血，體檢者于體檢當(dāng)日晨空腹抽取外周血2 ml用乙二胺四乙酸鉀(EDTA-K2)抗凝。CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞檢測：取兩支試管各加入100 μl肝素抗凝全血，一管加入10 μl anti-CD4-PC5、20 μl anti-CD25-FITC、20 μl anti-CD127-PE，另一管加入anti-CD4-PC5、鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE各10 μl作為同型對照，室溫避光孵育15 min，加入1 ml溶血素15 min后離心棄上清液，加入500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻后上機(jī)檢測。Th17細(xì)胞檢測：取抗凝全血150 μl與等體積RMPI1640混合，加入7.5 μl濃度為1 μg/ml的PMA、6 μl濃度為50 μg/ml的IO及6 μl濃度為0.5 mg/ml的BFA工作液，使其終濃度分別為25 ng/ml、1 μg/ml、10 μg/ml，放入培養(yǎng)箱中在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 h，繼之加入10 μl anti-CD4-PC5室溫避光反應(yīng)15 min，再加入等體積A液(8%多聚甲醛)室溫避光反應(yīng)15 min固定，加入1 ml PBS離心洗滌，棄上清液加入等體積B液(皂素)破膜分成兩管，第一管加入鼠抗人IgG1-PE、IgG1-FITC各10 μl作為同型對照，第二管加入鼠抗人anti-IL-17-PE 10 μl，避光反應(yīng)15 min后，再分別加入1 ml PBS離心洗滌，棄上清液，加入500 μl PBS混勻后上機(jī)檢測。每個樣本分析5 000個CD4+細(xì)胞，采用Cell Quest分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，以在CD4+T細(xì)胞百分比表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組外周血Treg、Th17表達(dá)量的比較老年肺癌組外周血中Treg、Th17的表達(dá)量明顯高于老年健康組、老年非癌組以及年輕健康組(P均<0.05)；而老年非癌組與老年健康組比較，兩者表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。老年健康組Treg的表達(dá)量顯著高于年輕健康組(P<0.05)；而Th17表達(dá)量在老年健康組與年輕健康組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.2老年肺癌組外周血Treg、Th17的表達(dá)量與肺癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系 隨著病程的進(jìn)展和加重，老年NSCLC患者外周血Treg、Th17的表達(dá)水平逐漸增高，其中Ⅲ～Ⅳ期病例高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，低分化癌者高于中高分化癌者(P<0.01或P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.01)；而不同病理類型肺癌之間比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其中因腺鱗混合癌樣本含量較少(3例)，考慮其樣本均數(shù)可信度較差，故未作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見表2。

組別nTregTh17老年肺癌組656.96±1.061)2)4.48±1.111)2)老年非癌組305.93±0.801.74±0.62老年健康組305.89±0.931.67±0.52年輕健康組304.17±0.821)2)1.89±0.57F/P值59.52/<0.0001129.77/<0.0001

與老年健康組比較:1)P<0.05；與老年非癌組比較：2)P<0.05

肺癌臨床特征nTregTh17臨床分期 Ⅰ～Ⅱ期265.99±0.983.91±0.65 Ⅲ～Ⅳ期397.34±0.951)4.85±1.071)病理類型 鱗癌286.85±1.164.45±1.02 腺癌256.97±0.694.69±1.09 其他127.16±1.224.35±1.15分化程度 中高分化356.31±0.874.18±0.92 低分化307.72±0.721)4.82±1.052)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無256.11±0.783.96±0.93 有407.49±0.851)5.10±0.961)

相同臨床特征之間比較：1)P<0.01,2)P<0.05

3討論

Th17是一種新型CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，具有獨(dú)立的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，能通過分泌IL-17、IL-21等多種炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，是近年來免疫學(xué)研究中的一個熱點(diǎn)。有研究表明,與健康人相比胰腺癌患者外周血中Th17細(xì)胞的比例明顯增高〔5〕,而結(jié)直腸癌患者腫瘤組織內(nèi)Th17細(xì)胞比例也明顯高于非腫瘤組織內(nèi)水平〔6〕。Th17數(shù)量的增加勢必引起效應(yīng)性細(xì)胞因子的分泌，而作為其主要效應(yīng)細(xì)胞因子的IL-17可以上調(diào)成纖維細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中新血管生成而促進(jìn)腫瘤生長〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Th17在老年肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

Treg是體內(nèi)存在的另一類功能獨(dú)特的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，它能夠分泌lL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β，對效應(yīng)T淋巴細(xì)胞具有抑制作用，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)CD127的CD4+CD25+T細(xì)胞才是真正的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞〔8〕，因此，同時檢測CD4+、CD25+和CD127low這3個指標(biāo)，可以更精確地定義Treg細(xì)胞群體。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Treg細(xì)胞在老年肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起關(guān)鍵作用。Treg細(xì)胞除了通過抑制CD4+T細(xì)胞的增殖來破壞了T淋巴細(xì)胞亞群之間的平衡外，還可以通過分泌IL-10來抑制細(xì)胞免疫的功能，IL-10增高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視〔9〕。

Th17和Treg來源于共同的初始T細(xì)胞，雖在不同的細(xì)胞因子環(huán)境下分化而成，但兩者的分化均依賴于TGF-β，低濃度的TGF-β在IL-6的協(xié)同作用下能誘導(dǎo)Th17轉(zhuǎn)化因子ROR-γt的產(chǎn)生,使活化的初始CD4+T細(xì)胞分化為促炎的Thl7；而高濃度的TGF-β卻抑制了ROR-γt的表達(dá)和功能，并能上調(diào)Treg轉(zhuǎn)錄因子PoxP3的表達(dá)進(jìn)而分化為抗炎的Treg〔10〕。因此，促炎性Th17與抑制性Treg在分化上的相互抑制導(dǎo)致其功能上也存在相反作用〔11〕，兩者間的平衡對于維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在老年肺癌外周血中Th17和Treg沒有出現(xiàn)此消彼長的情況，而是同步升高，且均與臨床TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān)，提示Treg與Th17之間相互作用可能下調(diào)了機(jī)體的免疫功能，從而促進(jìn)了腫瘤免疫逃逸的發(fā)生發(fā)展。但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Treg的表達(dá)量在老年健康組較年輕健康組顯著升高，提示Treg在免疫衰老中起著重要作用，這與文獻(xiàn)報道基本一致〔12〕。但Th17的表達(dá)量在這兩組中并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這也許是老年人對于感染、腫瘤等疾病易感，自身免疫性疾病的發(fā)病率較低的原因之一。Treg具有免疫無能性和免疫抑制性，其伴隨增齡而增多勢必引起機(jī)體免疫功能的低下，削弱了機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力，從而產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸，最終導(dǎo)致機(jī)體對于腫瘤易感。腫瘤細(xì)胞又可分泌TGF-β、IL-10，從而誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的初始CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg，腫瘤細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL22，促使高表達(dá)CCL22受體CCR4的Treg遷移到腫瘤微環(huán)境，Treg又在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了免疫抑制作用〔13〕，二者相關(guān)協(xié)同更加促進(jìn)老年肺癌的發(fā)生和進(jìn)展。呈增齡性改變的Treg可導(dǎo)致機(jī)體免疫衰老，同時也可導(dǎo)致腫瘤發(fā)病率增高，推測免疫衰老與腫瘤免疫可能存在某些共同調(diào)控機(jī)制。因此，對于Treg細(xì)胞進(jìn)行檢測及調(diào)控可為衰老及腫瘤的免疫監(jiān)測、免疫治療提供一定科學(xué)依據(jù)。

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〔2015-02-17修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：王翎(1964-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要從事老年呼吸及免疫衰老的基礎(chǔ)與臨床研究。

基金項(xiàng)目：蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項(xiàng)目資助(No.KJXW2012002)

中圖分類號〔〕R734.2〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6828-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.083