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      當(dāng)歸多糖對結(jié)腸炎小鼠peyer's patches結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群水平的調(diào)控作用*

      2016-01-29 03:05:39潘琦虹李燕珍劉端勇趙海梅江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院南昌33005江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院南昌330004
      江西中醫(yī)藥 2015年10期
      關(guān)鍵詞:潰瘍性結(jié)腸炎

      ★ 潘琦虹 李燕珍 劉端勇 趙海梅 (.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院 南昌 33005;.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南昌 330004)

      *基金項(xiàng)目:江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)科研計劃項(xiàng)目(2008A068)。

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      當(dāng)歸多糖對結(jié)腸炎小鼠peyer's patches結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群水平的調(diào)控作用*

      ★潘琦虹1李燕珍1劉端勇1趙海梅2**(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院南昌 330025;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院南昌 330004)

      *基金項(xiàng)目:江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)科研計劃項(xiàng)目(2008A068)。

      摘要:目的:探討當(dāng)歸多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠小腸peyer's patches結(jié)(PP結(jié))T淋巴細(xì)胞亞群水平的調(diào)控作用。方法:50只雄性小鼠分成5組,正常對照組(normal)、模型對照組(model)、當(dāng)歸多糖低劑量觀察組(low)、當(dāng)歸多糖高劑量觀察組(high)、柳氮磺吡啶陽性對照組(SASP),采用傳統(tǒng)的TNBS乙醇復(fù)合法建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,給藥7d后,觀察小鼠病理組織學(xué)變化,并分離其小腸上皮淋巴細(xì)胞,檢測各種淋巴細(xì)胞亞群水平。結(jié)果:各觀察組結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸損傷評分、病理組織學(xué)評分較模型組明顯下降(P<0.01或P<0.05)。同時當(dāng)歸多糖在一定的劑量下,可明顯下調(diào)PP結(jié)中CD4+、CD8+T細(xì)胞水平(P<0.01或P<0.05),且高劑量組可降低CD4/CD8水平(P<0.05)。結(jié)論:當(dāng)歸多糖可緩解潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸粘膜損傷,且緩解作用可能與調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠小腸PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群平衡、糾正腸粘膜免疫狀態(tài)的紊亂有關(guān)。

      關(guān)鍵詞:當(dāng)歸多糖;潰瘍性結(jié)腸炎;淋巴細(xì)胞亞群;粘膜免疫

      潰瘍性結(jié)腸炎是一種以結(jié)腸(直腸)粘膜慢性炎癥和潰瘍形成為特點(diǎn)的疾病,其發(fā)病與粘膜免疫狀態(tài)密切相關(guān)。據(jù)報道,當(dāng)歸多糖可調(diào)節(jié)免疫及治療實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)炎,但其能否調(diào)節(jié)粘膜免疫治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用并沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

      1實(shí)驗(yàn)材料

      1.1動物昆明小鼠50只,清潔級,18~22g,雄性,購于湖南景達(dá)斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司(SCXK 2009-0004)。

      1.2藥物當(dāng)歸多糖購于江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房,經(jīng)中藥鑒定室鑒定,由教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取分離,純度為95%,干燥粉末,-4℃下保存?zhèn)溆谩A沁拎?SASP)(滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第002083號)由上海三維制藥有限公司生產(chǎn)。

      1.3主要試劑及儀器2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)購于sigma公司(2508-19-2),單克隆熒光標(biāo)記抗體CD3-PE、CD4-APC、CD8-FITC均購于eBioscience公司。光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司)、Leica圖像分析儀(LEICA DC100,德國LEICA公司)、流式細(xì)胞儀(FACSCalibur型,美國BD公司)

      2實(shí)驗(yàn)方法

      2.1造模方法[1]模型對照組、當(dāng)歸多糖觀察組、柳氮磺吡啶陽性對照組動物,復(fù)合麻醉劑麻醉后,用塑料軟管(直徑1mm)插入肛門4cm,按體重注入100mg/kg含30%乙醇的TNBS藥液,小鼠倒立1min使藥液達(dá)全結(jié)腸,然后動物放回原籠中自然蘇醒;正常對照組小鼠注入等量的生理鹽水。

      2.2分組與給藥昆明小鼠50只,經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,按體重隨機(jī)分為5組,即正常對照組、模型對照組、當(dāng)歸多糖高劑量觀察組、當(dāng)歸多糖低劑量觀察組、柳氮磺吡啶陽性對照組,每組10只。造模成功后第1d,按體表面積換算,當(dāng)歸多糖低、高劑量觀察組分別給予0.5g/kg、1g/kg灌胃給藥;而柳氮磺吡啶對照組給予60mg/kg;正常組和模型組均給予等容積的蒸餾水同等方法灌胃,連續(xù)給藥7d,每天一次。第8d脫椎處死動物,分離小腸、結(jié)腸等,待用。

      2.3取材各組動物在末次給藥后禁食12 h,脫椎處死動物,迅速自肛門上2cm處向上分離結(jié)腸6~8cm,稱重,計算結(jié)腸重量指數(shù)(結(jié)腸指數(shù)=結(jié)腸重(g)/體重(kg)×100%)。剪取部分結(jié)腸組織,10%福爾馬林溶液固定,病理切片,HE染色,光鏡下觀察潰瘍生成情況,部分結(jié)腸組織迅速于液氮中保存待用。分離小腸,收集小腸PP結(jié)。

      2.4結(jié)腸組織損傷評分及評分標(biāo)準(zhǔn)動物處死后,迅速分離結(jié)腸,沿腸系膜縱軸剪開,用生理鹽水沖洗干凈,并將腸粘膜向上平鋪于蠟板上固定,觀察炎癥及潰瘍發(fā)生情況,根據(jù)炎癥損傷程度進(jìn)行結(jié)腸組織損傷評分,其評分標(biāo)準(zhǔn)[2]為:0分:無損傷;1分:粘膜充血、水腫、未出現(xiàn)潰瘍;2分:粘膜充血、水腫、輕度糜爛,無潰瘍;3分:粘膜充血、水腫、中度糜爛,有單個潰瘍;4分:粘膜充血、水腫、高度糜爛,有多處潰瘍;5分:粘膜充血、水腫、重度糜爛,有>1cm潰瘍。鏡下病理損傷評分參考Dielman等[3]提出的評分標(biāo)準(zhǔn),評分指標(biāo)包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、及病變深度,按有無及輕重分別記0、1、2分,病變深度達(dá)黏膜下層、肌層、漿膜層分別計1、2、3分。各項(xiàng)相加得總分。

      2.5機(jī)械分離法分離小腸PP結(jié)淋巴細(xì)胞禁食12h后,脫椎處死動物,取出全部小腸,置于冰生理鹽水中,剝離腸系膜和脂肪組織,用生理鹽水沖洗腸腔5~7遍,洗去小腸內(nèi)容物,從小腸腸壁上剪下的PP結(jié),置冰生理鹽水中反復(fù)清洗3~5遍,將PP結(jié)置于300目細(xì)胞篩中,加適量1640培養(yǎng)液研碎,制成PP結(jié)組織勻漿,濾液1500rpm,離心5min,去上清,兩次,加入1mL的1640培養(yǎng)液搖勻,即得。

      2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群檢測分別取細(xì)胞懸液100μL與CD3(0.5μg)/CD4單克隆抗體(0.25μg)和CD3(0.5μg)/CD8單克隆抗體(0.125μg)的離心管中震勻,4℃下孵育30min;加入適量生理鹽水,以1500 r/min離心1.5min,反復(fù)幾次,棄其上清,加生理鹽水恢復(fù)體積至500μL,過濾后上流式細(xì)胞儀檢測。

      3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      3.1結(jié)腸損傷評分見表1。肉眼下可見模型組結(jié)腸粘膜明顯充血、水腫,中到重度糜爛和多個潰瘍,潰瘍呈圓形或橢圓形,底部干凈,或可見少量淡黃色覆蓋物,邊緣充血水腫;鏡下可見粘膜糜爛脫落、充血水腫,炎癥細(xì)胞浸潤,形成多個潰瘍?nèi)睋p,結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸損傷評分及病理組織學(xué)評分明顯高于正常組(P<0.01);各觀察組亦可見少量充血水腫和部分結(jié)腸可見輕度糜爛和潰瘍,鏡下可見潰瘍數(shù)目明顯減少,底部可見纖維結(jié)締組織增生,充血水腫明顯減輕,伴少量炎癥細(xì)胞浸潤,與模型組比較結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸損傷評分及病理組織學(xué)評分明顯下降并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。提示當(dāng)歸多糖各劑量組可明顯緩解結(jié)腸損傷局部充血水腫,減輕炎癥細(xì)胞浸潤程度,減少潰瘍數(shù)目,促進(jìn)結(jié)腸上皮損傷修復(fù)、潰瘍愈合。

      表1 結(jié)腸粘膜損傷修復(fù)情況

      注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01,#P<0.05。

      3.2小腸粘膜PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平見表2。與正常組比較,模型組小鼠腸道PP結(jié)淋巴細(xì)胞中CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降,并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而CD4+T細(xì)胞有上升趨勢,CD8+T細(xì)胞有下降趨勢,不過其二者比值(CD4/CD8)顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,各觀察組對CD3+T淋巴細(xì)胞作用不明顯,均可明顯下調(diào)CD4+、CD8+T細(xì)胞水平,高劑量組及柳氮磺吡啶對照組可使CD4/CD8升高,并具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

      表2 小腸PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群水平

      注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

      4討論

      性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病,主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克隆病,目前普遍認(rèn)為IBD的產(chǎn)生主要來自于黏膜免疫、相關(guān)基因和環(huán)境因素,效應(yīng)T細(xì)胞的活化是腸黏膜免疫及其后續(xù)炎癥的起點(diǎn),外周T細(xì)胞亞群中,已明確CD4+T細(xì)胞是導(dǎo)致腸黏膜炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞。腸道共生的微生物抗原刺激腸黏膜T細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞或非典型NKT細(xì)胞活化后,分泌IL-13,IL-4,IL-5等。腸黏膜免疫調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致炎癥性腸病的發(fā)生,表現(xiàn)與潰瘍性結(jié)腸炎相似[5-6]。在本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞水平顯著升高正好印證了這一點(diǎn)。當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸中的主要成分之一?,F(xiàn)代藥理學(xué)表明,當(dāng)歸多糖具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、對血液循環(huán)系統(tǒng)、抗腫瘤、抗放射損傷等其他方面的作用[6]。當(dāng)歸多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑和抗放射損傷劑已應(yīng)用于臨床,但治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床應(yīng)用鮮見報道。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)歸多糖可以通過降低大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù),顯著降低MDA、NO含量,MPO活性及IL-2、TNF-α水平SOD活性,升高TGF-β、IL-10水平,表明當(dāng)歸多糖可通過拮抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)作用,緩解免疫性結(jié)腸炎大鼠炎癥反應(yīng),減輕結(jié)腸損傷[7]。正如本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明,當(dāng)歸多糖給藥后小鼠結(jié)腸少量充血水腫和部分結(jié)腸可見輕度糜爛和潰瘍,鏡下可見潰瘍數(shù)目明顯減少,底部可見纖維結(jié)締組織增生,充血水腫明顯減輕,伴少量炎癥細(xì)胞浸潤,病理損傷評分明顯下降,提示當(dāng)歸多糖可有效治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎,同時當(dāng)歸多糖在一定的劑量下,可明顯下調(diào)PP結(jié)中CD4+、CD8+T細(xì)胞水平,下調(diào)CD4/CD8水平,表明當(dāng)歸多糖可能是通過明顯調(diào)節(jié)腸道粘膜免疫系統(tǒng)T淋巴細(xì)胞亞群平衡,恢復(fù)免疫耐受狀態(tài),進(jìn)而防止或降低致炎因子的分泌或高表達(dá),減輕炎性損傷,從而治療潰瘍性結(jié)腸炎。當(dāng)然,當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)腸道粘膜免疫細(xì)胞平衡的分子基礎(chǔ)未得到很好的詮釋,是否和T淋巴細(xì)胞的活化,活化的途徑,與抗原遞呈細(xì)胞活化相關(guān)性等等并不清楚,還有待于進(jìn)一步的深入研究。

      參考文獻(xiàn)

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      收稿日期:(2015-06-22)編輯:翟興英

      中圖分類號:R285.5

      文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B

      通信作者:**趙海梅(1979—),女,博士,副教授。研究方向:中醫(yī)臨床基礎(chǔ)。Tel:0791-86588407,E-mail:haimei79@163.com。

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