★　楊軍平　(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院　南昌 330006)

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自擬通痹湯對實驗性關(guān)節(jié)炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

★楊軍平(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南昌 330006)

摘要：目的：研究自擬通痹湯對實驗性關(guān)節(jié)炎小鼠單核吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬功能、脾細胞抗體生成及遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響，探討自擬通痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機理。方法：從吞噬指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值，脾細胞抗體生成的量，耳腫脹值及胸腺指數(shù)探討自擬通痹湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠免疫調(diào)節(jié)的變化。結(jié)果：自擬通痹湯給藥組的吞噬指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值與模型組比較無顯著性差異；自擬通痹湯給藥組的脾細胞抗體生成量與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)；自擬通痹湯高劑量組耳腫脹值與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論：自擬通痹湯能降低實驗性關(guān)節(jié)炎小鼠脾細胞抗體生成的量,抑制遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)其免疫功能。

關(guān)鍵詞：自擬通痹湯；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；免疫功能

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜組織炎性改變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊。浒l(fā)病原因可能與遺傳、感染及性激素等有關(guān)。RA的病理變化是滑膜組織的炎癥反應(yīng)加劇,形成血管翳侵入并破壞軟骨，侵蝕軟骨下骨組織,最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞[1-2]。

自擬通痹湯是我院喻建平主任的臨床經(jīng)驗方，由通痹風(fēng)藤、虎杖、羌獨活、寒水石等組成。自擬通痹湯具有清熱祛風(fēng)除濕、消腫止痛之功效，適用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎濕熱痹阻證[3]。自擬通痹湯經(jīng)多年臨床應(yīng)用,療效顯著。本研究從動物實驗角度，觀察自擬通痹湯對實驗性關(guān)節(jié)炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)的影響，探討中藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機理。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物10個月齡昆明種小鼠(由江西中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供)，二級，體重(20±1)g，雌雄各半，明暗為自然光線，室溫(24±1)℃、濕度50%±5%，適應(yīng)環(huán)境一周。適應(yīng)期動物可自由攝食和飲水。動物合格證號為：2012-021。

1.1.2主要儀器電子分析天平(型號：XS105DU,瑞士梅特勒托利多進口電子分析天平廠家)；超級恒溫箱(規(guī)格型號：501-A，深圳市寶域科技有限公司)；紫外可見分光光度計(型號：7230G,上海天普分析儀器有限公司)；低溫離心機(型號：ALLegra X-15R，美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.1.3主要試劑和實驗藥物2，4二硝基氟苯(DNFB)，上海士鋒生物科技有限公司，批號950411，分析純。綿羊紅細胞，實驗室制備。自擬通痹湯:配制成生藥粉,由江西省中醫(yī)院制劑研究室提供，批號121104。強的松：浙江仙琚制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H33021207，批號1206018。濕熱痹顆粒：遼寧好護士藥業(yè)(集團)有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z21021523，批號20121201。

1.2方法

1.2.1單核吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬功能昆明小鼠60只，體重(20±1)g，雌雄各半，動物稱重后按組放置不同的實驗間，分籠喂養(yǎng)。采用隨機法隨機分為六組:模型對照組、西藥對照組、中藥對照組、自擬通痹湯高劑量給藥組、自擬通痹湯中劑量給藥組、自擬通痹湯低劑量給藥組，每組10只。分組后模型對照組給予等體積的蒸餾水，其余各組按不同劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14d。在末次給藥1h后，從尾靜脈注射印度墨汁，每只注射0.1mL，分別在注射1min、5min后取血20μL，分別加到2mL的0.1%碳酸鈉溶液中,輕輕搖勻，測吸光度值(650nm波長)；小鼠處死后，在冰面上迅速取出肝臟、脾臟，稱重。

計算公式：

1.2.2脾細胞抗體生成昆明小鼠60只，體重(20±1)g，雌性，動物稱重后按組放置不同的實驗間。采用隨機法隨機分為六組:模型對照組、西藥對照組、中藥對照組、自擬通痹湯高劑量給藥組、自擬通痹湯中劑量給藥組、自擬通痹湯低劑量給藥組，每組10只。分組后模型對照組給予等體積的蒸餾水，其余各組按不同劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14d。

綿羊紅細胞的制備：脫纖維防凝處理的綿羊血，加入適量生理鹽水混勻，2000r·min-1離心5min，棄上清，再加入適量的生理鹽水混勻，2000r·min-1離5min，棄上清，利用生理鹽水分別配制成不同濃度。

補體制備:綿羊紅細胞1mL加到5mL的豚鼠血清中，放置4℃環(huán)境下,不停振蕩30分鐘，1500 r·min-1，離心20min,分離的血清保存在-70℃超低溫冰箱。使用時血清用PBS緩沖液1∶10進行稀釋。給藥第10d開始，每組動物腹腔注射2%綿羊紅細胞，注射量為0.2mL。給藥第14日后，既小鼠免疫4天后,小鼠股動脈取血，處死，勻漿脾臟，細胞濃度調(diào)整至2×107mL-1，PBS緩沖液洗。把各1mL的細胞懸液、0.2%綿羊紅細胞、補體混合在一起，組成混合液，37℃環(huán)境放置1小時。1500r·min-1，離心20min,取上清液，測吸光度值(波長540nm)。

1.2.3小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)昆明小鼠70只，體重(20±1)g，雌雄各半，動物稱重后按組放置不同的實驗間。采用隨機法隨機分為七組:正常對照組、模型對照組、西藥對照組、中藥對照組、自擬通痹湯高劑量給藥組、自擬通痹湯中劑量給藥組、自擬通痹湯低劑量給藥組，每組10只。分組后正常對照組、模型對照組給予等體積的蒸餾水，其余各組按劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14d。

正常對照組外，其余各組小鼠腹部去毛，面積大小約為3cm×3cm，然后將1%二硝基氟苯溶液輕輕地擦拭在去毛范圍處，每日涂抹1次,進行致敏。致敏到第5d，將10μL 1%二硝基氟苯溶液均勻擦拭在小鼠左耳朵(正反面),并對小鼠進行攻擊。攻擊24h后，處死小鼠，分別剪下小鼠的兩只耳殼，用打孔器打出耳片,直徑約8mm，并稱重。同時在冰面上迅速取出小鼠胸腺及脾臟，稱重并計算臟器指數(shù)=臟器重量/小鼠體重(mg·g-1)；以兩耳片重量的差值為耳腫脹值。

2結(jié)果

2.1自擬通痹湯對小鼠單核吞噬細胞系統(tǒng)吞噬功能的影響見表1。

表1　自擬通痹湯對小鼠單核

注：與模型對照組相比，*P<0.05。

通痹各劑量給藥組吞噬指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值與模型對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)，而西藥對照組的吞噬指數(shù)K值與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.2自擬通痹湯對小鼠脾細胞抗體生成的影響見表2。

表2　自擬通痹湯對小鼠脾細胞抗體生成的影響±s,n=10)

注：與模型對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

自擬通痹湯給藥各組吸光度值與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)，西藥對照組和中藥對照組吸光度值與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.3自擬通痹湯對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響見表3。

表3　自擬通痹湯對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響±s,n=10)

注：與正常對照組相比，▲▲P<0.01,與模型對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

模型對照組小鼠耳腫脹值與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.01)；自擬通痹湯高劑量給藥組耳腫脹值與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)，西藥對照組和中藥對照組耳腫脹值與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，自擬通痹湯中、低劑量給藥組與模型對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；西藥對照組、中藥對照組胸腺指數(shù)與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.01)；自擬通痹湯高劑量給藥組、西藥對照組、中藥對照組脾臟指數(shù)與模型對照組相比有顯著差異(P<0.01)。

3討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以慢性進行性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?，關(guān)節(jié)受累主要表現(xiàn)為滑膜炎癥、滲出、細胞增殖以及肉芽腫形成，當(dāng)關(guān)節(jié)累及軟骨或骨質(zhì)時造成軟骨及骨組織破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)強直及其功能障礙。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病主要是由細胞免疫系統(tǒng)與體液免疫系統(tǒng)兩方面的紊亂所造成的，它涉及到多形核細胞、血管內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、單核-巨噬細胞等，以及細胞因子與炎性介質(zhì)。我們分別從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能、特異性脾細胞抗體生成和遲發(fā)型超敏反應(yīng)三方面探討自擬通痹湯對實驗性關(guān)節(jié)炎小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的機理。

網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)的細胞具有很強的吞噬能力,能吞噬異物、細菌以及衰老與突變的細胞。它包括巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞以及肥大細胞。而吞噬殺傷作用可被補體的免疫粘附作用、特異性免疫中抗體的調(diào)理作用及細胞因子所加強。巨噬細胞與T淋巴細胞的表面協(xié)同刺激分子受體產(chǎn)生協(xié)同刺激信號，誘導(dǎo)T淋巴細胞活化，從而啟動免疫應(yīng)答。在免疫應(yīng)答的起始反應(yīng)階段，巨噬細胞通過處理抗原物質(zhì)、分泌IL-1、激活淋巴細胞來促進淋巴細胞的分裂與分化；在免疫應(yīng)答的效應(yīng)反應(yīng)階段，巨噬細胞集聚在病灶周圍，在淋巴因子的激活作用下，發(fā)揮巨噬細胞的屏障功能[4-5]。從表1可見,自擬通痹湯對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能無明顯影響。

機體的特異性體液免疫應(yīng)答主要是由B淋巴細胞介導(dǎo)，外來的抗原物質(zhì)進入機體后誘導(dǎo)B淋巴細胞活化并產(chǎn)生特異性的抗體，發(fā)揮重要的體液免疫作用。我們通過檢測B淋巴細胞活化產(chǎn)生的特異性抗體的水平來判斷B淋巴細胞的功能。將經(jīng)綿羊紅細胞免疫后的小鼠脾細胞與一定量的綿羊紅細胞混合，在補體參與作用下，產(chǎn)生特異性抗體。檢測特異性抗體水平的指標(biāo)是測量脾細胞周圍結(jié)合了抗體分子的羊紅細胞所溶解后形成的溶血空斑。溶血空斑的大小表示脾細胞抗體形成量的多少[4-5]。從表2可知，自擬通痹湯能明顯降低綿羊紅細胞致敏的脾細胞抗體形成量，明顯抑制體液免疫應(yīng)答。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生與吞噬細胞、效應(yīng)T細胞、細胞毒性介質(zhì)等密切相關(guān)。這是由于效應(yīng)T細胞作用于相應(yīng)的抗原后，出現(xiàn)了細胞浸潤和組織損傷等炎癥反應(yīng)的重要形態(tài)特征[4-5]。從實驗結(jié)果可以看出,自擬通痹湯對二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)有明顯的抑制作用,對特異性細胞免疫有抑制作用。

本研究表明自擬通痹湯只對體液免疫和細胞免疫起作用,對非特異性屏障機能不產(chǎn)生影響，這充分說明該治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物是非常有臨床價值的。因此，在臨床應(yīng)用時，自擬通痹湯對治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎既可起到針對性的治療效果，又可避免因廣泛的免疫抑制變化而出現(xiàn)的毒副作用。同時闡明自擬通痹湯對實驗性小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫調(diào)節(jié)作用，為該藥清熱除濕、消腫止痛的免疫調(diào)節(jié)機制提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1]張婷婷,羅靜，李小峰.不規(guī)則趨化因子簡介及其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用[J].中國藥物與臨床，2014(7)：914-917.

[2]Noori S.Immunosuppressive activity of a moLecuLe isoLated from Artemisia annua on DTH responses compared with cycLosporin A[J].ImmunopharmacoL,2004,4(10):1 301-1 306.

[3]楊軍平,邱麗瑛,肖亮,等.自擬通痹湯對II型膠原性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的作用[J].中國組織工程研究,2012,16(42):7 843-7 848.

[4]張赟,溫偉紅.細胞和分子免疫學(xué)實用實驗技術(shù)[M].北京：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社,2013.

[5]何維.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

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收稿日期：(2015-07-11)編輯：翟興英

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)識碼：B