黃　靖，鄒　燁，王　未，李　倩，吳慧玉，趙　婷，茆廣華，張　敏，仰榴青*

(1．江蘇大學 化學化工學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；　2．江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；

3．江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；　4.江蘇大學 環(huán)境與安全工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

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肉蓯蓉多糖鋅的制備、表征及抗氧化活性

黃靖1，鄒燁2，王未2，李倩2，吳慧玉3，趙婷1，茆廣華4，張敏1，仰榴青1*

(1．江蘇大學 化學化工學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2．江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；

3．江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；4.江蘇大學 環(huán)境與安全工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

摘要：采用超聲酶法輔助提取肉蓯蓉粗多糖，并用季銨鹽沉淀法對肉蓯蓉粗多糖進行精制，獲得肉蓯蓉精制多糖(UCEP1)；以UCEP1和硫酸鋅為原料，制備了肉蓯蓉多糖鋅配合物(UCEP1-Zn)，對其結構進行了表征，并研究其抗氧化活性. 結果表明，肉蓯蓉粗多糖收率及含量分別為22.31%和48.50%，UCEP1中多糖含量為70.13%；UCEP1-Zn中-OH和-COO-和Zn2+發(fā)生了配位，其中鋅含量為7.57%，且多糖鏈構象及多糖分子表面形貌發(fā)生變化；UCEP1-Zn的抗氧化能力顯著高于UCEP1，且對ABTS+自由基清除活性最好. 該研究可為肉蓯蓉多糖、新型鋅營養(yǎng)素補充劑以及鋅功能配合物的研究和利用提供參考.

關鍵詞：肉蓯蓉；多糖；鋅；配合物；結構表征；抗氧化活性

Preparation, characterization and antioxidant activity of

管花肉蓯蓉(Cistanchetubulosa(Schrenk) R. Wight)屬列當科寄生植物，主要分布于非洲北部和亞洲西部[1]. 它干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖中的活性物質(zhì)(如多糖)能夠促進血液循環(huán)、治療陽痿、腰痛和不孕不育等疾病[2]. 多糖主要存在于動物、植物和微生物中，具有較高的安全性、低毒性、可降解性和高度生物相容性. 多糖因具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、提高免疫等生物活性[3-9]，而引起人們的廣泛關注. 微量元素是人體所需營養(yǎng)成分中的重要組成部分，是生命體消化過程中能量轉換和組織構成的重要因素，其中鋅是生物正常生長發(fā)育所必須的微量元素之一，是人體內(nèi)酶的激活劑，對維持人體正常生理功能，提高免疫力，促進身體與智力發(fā)育具有重要的作用[10]. 本文作者采用肉蓯蓉精制多糖(UCEP1)與鋅(II)制備肉蓯蓉多糖鋅配合物(UCEP1-Zn)，對肉蓯蓉多糖及其鋅配合物進行結構表征，并研究其抗氧化活性，該研究可為肉蓯蓉多糖、新型鋅營養(yǎng)素補充劑以及鋅功能配合物的研究和利用提供參考.

1實驗部分

1.1　儀器和試劑

Nicolet 470傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；JASCO J-810-150S圓二色譜儀，日本JASCO公司；MFP-3D掃描探針顯微鏡，美國Asylum Research公司；JSM-7001F型熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社(JEOL)；BDX3300 X射線衍射儀.

肉蓯蓉莖購于新疆草本植物市場，經(jīng)鎮(zhèn)江食品藥品監(jiān)督管理局主任中藥師陳黎鑒定為列當科蓯蓉屬管花肉蓯蓉；硫酸鋅、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、氯化銨、鉻黑T、無水乙醇、95%乙醇、鄰二氮菲、七水合硫酸亞鐵、30%雙氧水、過硫酸鉀(K2S2O8)、氯化鈉、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；DPPH、ABTS購自Sigma-Aldrich公司.

1.2　實驗方法

1.2.1肉蓯蓉粗多糖的超聲纖維素酶法提取及精制

超聲酶法輔助提取肉蓯蓉多糖：準確稱取10.0 g肉蓯蓉粉末，置于500 mL圓底燒瓶中，加入2.5%(g/mL)纖維素酶，按料液比1∶30(g/mL)加入去離子水，調(diào)pH為6.0，設定超聲溫度為50 ℃，超聲酶解0.5 h. 提取結束后，100 ℃冷凝回流，攪拌提取2 h. 4 000 rpm離心10 min，旋轉蒸發(fā)，醇沉. 離心得沉淀，揮醇，冷凍干燥得肉蓯蓉粗多糖(UCEP). 實驗平行3次，按公式(1)計算多糖得率并采用苯酚硫酸法測定其含量[11].

內(nèi)蓯蓉多糖得率(%)=

(1)

三氯乙酸法脫蛋白：在冰浴、攪拌的條件下向UCEP溶液中逐滴加入15%的三氯乙酸，使其多糖溶液pH=1，4 ℃靜置4 h，4 500 rpm 離心20 min，收集上清液，在波長190~400 nm范圍內(nèi)掃描，觀測280和260 nm 處是否有吸收峰. 將脫蛋白后的多糖溶液用透析袋流水透析48 h，雙蒸水透析48 h，冷凍干燥得到肉蓯蓉多糖.

季銨鹽沉淀法精制肉蓯蓉多糖：將3%(g/mL)的CTAB溶液等體積加入0.8%(質(zhì)量濃度)的肉蓯蓉粗多糖溶液中，靜置12 h，10 000 rpm 離心5 min，收集上清液，醇沉，4 ℃靜置12 h，4 000 rpm 離心10 min收集沉淀. 沉淀經(jīng)溶解、透析、凍干后得到精制多糖UCEP1，測定其多糖含量.

1.2.2肉蓯蓉多糖鋅的制備

準確稱取0.25 g UCEP1置于100 mL圓底燒瓶中，加入25 mL去離子水使多糖溶解. 加入等體積的0.45 mol/L硫酸鋅溶液，室溫攪拌反應4 h，將反應液流水透析24 h，雙蒸水透析24 h. 收集透析后的液體，冷凍干燥，即得UCEP1-Zn[12].

1.2.3肉蓯蓉多糖及其鋅配合物的結構表征

取適量干燥的UCEP1和UCEP1-Zn樣品，與烘干的KBr粉末以1∶100混合研磨均勻，壓片，使用紅外光譜(FT-IR)，在波長在400~4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描分析峰位置的變化，并在室溫下用X射線衍射儀(XRD)記錄峰強度與峰位置的變化，X射線源為高強度Cu Kα線，測試電壓為40 kV，電流為30 mA，RS為0.3 mm，DS和SS為1°，掃描速率為7 °/min，掃描范圍為5°~90°. 使用EDTA滴定法測定UCEP1-Zn中鋅的含量，鋅含量按公式(2)計算：

(2)

將UCEP1和UCEP1-Zn配制成100 mg/L的溶液，采用圓二色譜儀(CD)進行測定，將色譜儀參數(shù)設定為：掃描波長190~250 nm，帶寬2.5 nm，時間常數(shù)2 s，掃描速率50 nm/min. 取3.0~5.0 μL樣品液滴在新鮮解離的云母片上，室溫干燥2 h. 采用原子力顯微鏡(AFM)于室溫下直接觀測多糖的分子形貌，接觸作用力控制在3~4 nN量級范圍內(nèi)，共振頻率為2.0 kHz. 將UCEP1和UCEP1-Zn樣品粘著于樣品盤上，置于真空噴鍍儀內(nèi)鍍導電金膜，采用熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察.

1.2.4肉蓯蓉多糖及其鋅配合物的抗氧化活性

參考文獻清除DPPH、OH和ABTS+自由基能力的測定分別[13]、[14]和[15]進行.

2結果與討論

2.1　肉蓯蓉多糖的超聲酶法提取及精制

在本文工藝下，超聲酶法輔助提取肉蓯蓉多糖的得率為22.31%，多糖含量為48.50%. 除蛋白后的肉蓯蓉多糖溶液在波長260和280 nm處無吸收. 經(jīng)過季銨鹽沉淀后，精制多糖UCEP1中多糖含量為70.13%，比粗多糖含量提高了44.59%.

2.2　肉蓯蓉多糖及其鋅配合物的結構表征

圖1為UCEP1與UCEP1-Zn的紅外光譜. 如圖所示，UCEP1位于3 387 cm-1處的寬峰是-OH的伸縮振動吸收峰，位于1 637 cm-1處的峰為-COO-的反對稱伸縮振動峰. UCEP1-Zn的紅外光譜與UCEP1相比主要差別為：1) UCEP1位于3 387 cm-1左右處的寬峰是-OH的伸縮振動峰，UCEP1-Zn中該吸收峰移至3 375 cm-1，表明UCEP1中的-OH參與了與Zn2+的配位；2) UCEP1位于1 637 cm-1的峰是-COO-的反對稱伸縮振動峰，UCEP1-Zn中該峰向低波數(shù)位移至1 631 cm-1，表明多糖鏈中-COO-參與了與Zn2+的配位. 圖2是UCEP1與UCEP1-Zn的XRD圖譜. 根據(jù)標準圖譜(PDF#22-1019)可知，ZnSO4·7H2O的XRD圖譜共有6個強銳峰，分別位于衍射角2θ值為19.89°、20.98°、21.60°、25.88°、31.03°和33.54°處，此外2θ位于10°~90°之間還存在一些小峰. 由圖可知，UCEP1 有3個峰，分別位于2θ值為12.98°、29.72°與42.88°處. 相比 29.72°和42.88°處的兩個寬峰，2θ位于12.98°的峰相對較為尖銳. 多糖鋅UCEP1-Zn的強銳峰位于13.35°，其原因是ZnSO4·7H2O加入后與肉蓯蓉多糖發(fā)生配位作用，形成了多糖鋅配合物，從而使得原本的晶格參數(shù)發(fā)生變化，其2θ由12.98°變化為13.35°. 且UCEP1-Zn的XRD圖譜中沒有發(fā)現(xiàn)ZnSO4·7H2O的特征衍射峰，表明Zn2+與UCEP1發(fā)生配位作用，并且Zn2+在糖鏈上高度分散.

圖1　UCEP1與UCEP1-Zn的紅外光譜圖Fig.1　Infrared spectra of UCEP1 and CEP1-Zn

圖2　UCEP1與UCEP1-Zn的X射線衍射圖Fig.2　X-ray diffraction patterns of UCEP1 and UCEP1-Zn

采用絡合滴定法測定肉蓯蓉多糖鋅UCEP1-Zn中的鋅含量，其值為7.57%. 李志洲等[10]研究了牛肝菌多糖鋅配合物的制備，測得鋅配合物中鋅含量為2.64%，低于本文中合成的肉蓯蓉多糖鋅中的鋅含量.

圖3為UCEP1與UCEP1-Zn在190~300 nm范圍內(nèi)的圓二色譜圖. 如圖所示，與UCEP1相比，UCEP1-Zn在210~220 nm之間的峰值明顯降低，此現(xiàn)象說明多糖與鋅形成配合物，使得多糖分子的不對稱性增加，導致多糖鏈的構象發(fā)生了變化. 圖4A與4B分別為UCEP1與UCEP1-Zn在水溶液中的原子力顯微電鏡照片. 在低濃度下，UCEP1多糖分子為均一顆粒狀，且分子間具有柔順性，而UCEP1-Zn分子有著可辨別的單個聚合物，其分子間不是簡單的疊加，而是分子間的相互作用. 圖5A和5B分別為UCEP1及UCEP1-Zn的掃描電鏡圖. 如圖5所示，UCEP1及UCEP1-Zn的表面形貌發(fā)生了明顯變化，由圖5A可知，肉蓯蓉多糖以纖維棒狀結構存在，纖維棒狀表面光滑. 當多糖與鋅發(fā)生配合作用后(圖5B)其表面變粗糙，且通過圖6的能譜分析可知其表面結合了鋅.

圖3　UCEP1與UCEP1-Zn的圓二色譜圖Fig.3　CD spectra of UCEP1 and UCEP1-Zn

A: UCEP1; B: UCEP1-Zn.圖4　UCEP1與UCEP1-Zn的原子力顯微鏡圖Fig.4　The AFM images of the polysaccharides and complexes

A: UCEP1; B: UCEP1-Zn.圖5　UCEP1與UCEP1-Zn的掃描電鏡圖Fig.5　SEM micrographs of the polysaccharides and complexes

圖6　UCEP1-Zn的能譜成分分析圖Fig.6　Energy spectrum analysis of UCEP1-Zn

2.3　UCEP1-Zn的抗氧化活性

清除DPPH·能力測試如圖7所示，在50~1 000 mg/L范圍內(nèi)，UCEP1-Zn對DPPH·的清除能力高于UCEP1；當濃度為1 000 mg/L時，UCEP1-Zn對DPPH·清除率達到33.71%，比配合前的多糖清除率提高16.24%. 清除·OH能力測定如圖8所示，在50~1 000 mg/L 范圍內(nèi)，UCEP1-Zn對OH·的清除能力高于UCEP1；當濃度為1 000 mg/L時，UCEP1-Zn對·OH清除率達到34.49%，比UCEP1清除率高18.72%. 清除ABTS+能力測試如圖9所示，在50~1 000 mg/L范圍內(nèi)，UCEP1-Zn對ABTS+的清除能力高于UCEP1；當濃度為1 000 mg/L時，UCEP1-Zn對ABTS+清除率達到36.83%，比UCEP1的清除率高18.80%.

圖7　UCEP1和UCEP1-Zn對DPPH·的清除能力Fig.7　DPPH· radical scavenging capacity of UCEP1 and UCEP1-Zn

圖8　UCEP1和UCEP1-Zn對OH·的清除能力Fig.8　OH· radical scavenging capacity of UCEP1 and UCEP1-Zn

UCEP1中含有羥基和羧基，作為給電子體，能與自由基作用達到清除自由基的效果，而UCEP1與鋅配位后，其羥基和羧基的給電子作用減弱，但清除自由基的能力反而增大，可能是UCEP1與鋅配合后，使配位部分與暴露的活性基團協(xié)同作用，促進與自由基的作用，因而清除自由基的能力增大[16]；另一方面，UCEP1與鋅配合后，與自由基反應生成的中間體可能更加穩(wěn)定，導致清除自由基的能力增大[17].

圖9　UCEP1和UCEP1-Zn對ABTS+的清除能力Fig.9　ABTS+ radical scavenging capacity of UCEP1 and UCEP1-Zn

3結論

采用超聲酶法輔助提取肉蓯蓉粗多糖，其多糖得率及含量分別為22.31%和48.50%. 經(jīng)銨鹽沉淀法精制獲得肉蓯蓉精制多糖(UCEP1)，其多糖含量達70.13%. 得到的肉蓯蓉多糖鋅配合物UCEP1-Zn，UCEP1中-OH和-COO-與Zn2+發(fā)生了配位，EDTA滴定法分析其鋅含量為7.57%. UCEP1-Zn形成后，多糖鏈構象及多糖分子表面形貌發(fā)生變化. 體外抗氧化活性研究表明，UCEP1-Zn的抗氧化能力顯著高于UCEP1，且對ABTS+自由基清除活性最高. 該研究可為肉蓯蓉多糖、新型鋅營養(yǎng)素補充劑以及鋅功能配合物的研究和利用提供參考.

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[責任編輯：吳文鵬]

CistanchetubulosaZn2+-polysaccharide complex

HUANG Jing1, ZOU Ye2, WANG Wei2, LI Qian2, WU Huiyu3,

ZHAO Ting1, MAO Guanghua4, ZHANG Min1, YANG Liuqing1*

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China;

2.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China;

3.SchoolofPharmacy,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China;

4.SchoolofEnvironmentandSafetyEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China)

Abstract:Cistanche tubulosa polysaccharides was extracted by ultrasonic-cellulase-assisted extraction and the refined polysaccharide (UCEP1) was prepared by quaternary ammonium salt precipitation. The Zn2+-polysaccharide (UCEP1-Zn) was prepared with ZnSO4and UCEP1 as raw material, and its characterization and antioxidant activity were also studied. The results showed that the yield and content of cistanchetubulosa polysaccharides was 22.31% and 48.50%, respectively, and the content of UCEP1 was 70.13%. The -OH group and the carboxyl group were involved, the chain conformation and variation on morphology were also changed after the formation of UCEP1-Zn, and the content of Zn2+was 7.57%. The antioxidant activity of UCEP1-Zn was significantly higher than that of UCEP1 and had the highest ABTS+radical scavenging activity. The study provided a reference for the research and application of Cistanche tubulosa polysaccharide, zinc supplement and zinc complexes.

Keywords:Cistanche tubulosa； polysaccharide; Zn; complex; characterization; antioxidant activity

作者簡介：黃靖(1990-)，女，碩士生，主要從事天然產(chǎn)物化學及應用研究.*通訊聯(lián)系人，E-mail：yangliuqing@ujs.edu.cn.

基金項目：浙江省科技計劃項目(2012C22008), 鎮(zhèn)江市科技計劃項目(GY2012002).

收稿日期：2015-04-29.

文章編號：1008-1011(2015)06-0584-06

中圖分類號：O69

文獻標志碼：A