馮燕兵錢 萍朱潔云翁文慶陳紅明

血小板源性生長因子C在家兔視網膜靜脈阻塞模型的表達研究

馮燕兵1錢 萍1朱潔云2翁文慶1陳紅明1

目的研究家兔視網膜靜脈阻塞（RVO）模型血小板源性生長因子C（PDGF-C）表達、作用及參與RVO新生血管形成的相關機制。方法通過氬激光光凝建立視網膜靜脈阻塞家兔模型，觀察結束后分別在1周、2周及4周三個時相點處死家兔，采取標本，觀察病理改變，免疫組化法觀察PDGF-C蛋白表達情況。結果與空白對照組比較，RVO家兔模型視網膜組織中各時相（1周、2周和4周組）PDGF-C蛋白表達均有不同程度的增高，差異有統計學意義 [（4.833±1.835）pg/mL、（10.500±1.634）pg/mL、（5.167±1.835）pg/mL比（2.167±0.408）pg/mL，孕＜0.01]，其中2周模型組與1周、4周模型組比較差異有統計學意義（孕＜0.01），1周模型組與4周模型組比較，孕=0.713。結論PDGF-C在家兔視網膜靜脈阻塞血管內皮細胞中呈現高表達，預示其可能在RVO發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且其表達程度與視網膜缺血具有一定的時間相關性。

家兔；視網膜靜脈阻塞；PDGF-C；蛋白

視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是一種以阻塞靜脈遠端迂曲擴張、阻塞點附近視網膜出血、水腫、滲出為臨床特征，發(fā)病僅次于糖尿病性視網膜病變的視網膜血管疾病。RVO病程冗長，視網膜因缺血缺氧，多種因素導致新生血管形成，血管通透性提高，引發(fā)黃斑水腫、視網膜出血、玻璃體積血等嚴重危害視力的并發(fā)癥。目前認為血管生成因子與血管抑制因子失衡是新生血管形成的主要機制。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促進血管新生最重要的誘導因子[1]，近期研究表明，血小板源性生長因子C（plate let-derived growth factor-C，PDGF-C）在新生血管形成中同樣發(fā)揮重要作用，其不僅能單獨促進新生血管生成，同時對同為血管生成因子的VEGF具有促進作用[2]。本實驗通過激光光凝建立兔RVO模型，觀察視網膜組織中PDGF-C蛋白表達，探討其在RVO發(fā)病中的作用及相關機制，為臨床防治RVO提供數據支持。

1 材料

1.1 動物及分組 普通級健康實驗家兔14只，購自嘉興學院醫(yī)學院動物實驗中心，許可證號:SCXK（浙）2013-0056，眼前節(jié)、眼底檢查無異常，白色，雌雄不限，體質量約2.0～2.5kg，隨機分為空白對照組（5只，10眼）與模型組（9只，18眼）兩組。

1.2 藥品及試劑 復方托吡卡胺滴眼液（山東博士倫福瑞達制藥有限公司生產，批號H20023089）；20%烏拉坦（嘉興學院醫(yī)學院提供）；10%的中性甲醛固定液、雙氧水（嘉興市中醫(yī)院病理科提供）；PDGF-C（一抗:艾博抗貿易有限公司，二抗:碧云天生物技術有限公司）；胃酶抗原修復液（福建邁新生物技術開發(fā)公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

2 方 法

2.1 動物模型制作 模型組兔參照盧海等[3]介紹激光造模方法造模，復方托吡卡胺滴眼液充分擴瞳，20%烏拉坦全身麻醉，先拍攝無赤光眼底像，角膜表面麻醉，放置三面鏡，以氬離子激光封閉兔視網膜視乳頭兩側髓翼血管系之主干靜脈（光凝斑直徑200～250μm，功率600～800mW，時間0.3～0.5s）。造模中激光光準確聚焦主干靜脈，不傷及鄰近動脈，參照文獻[3]光凝封閉的靜脈段長度約1PD，直至被封閉靜脈變細發(fā)白，血流停滯，遠端迂曲擴張，且由遠端向近端光凝照射。激光光凝封閉視網膜靜脈24h后作眼底彩色照相及眼底血管造影（FFA）觀察血管閉塞情況，驗證造模是否成。若閉塞不完全則補充光凝封閉，封閉視網膜靜脈后拍攝眼底無赤光像，并再行FFA證實靜脈已被阻塞，血流中斷。術后每日散瞳，檢眼鏡查眼底（1周內每天1次，以后每周1次，觀察阻塞血管與視網膜改變），同時觀察眼前段。

2.2 視網膜組織HE染色與免疫組織化學染色 分別在造模后第1周、第2周及第4周，空氣處死動物，及時摘除眼球，并去除眼前節(jié)及玻璃體形成眼杯，移入10%中性甲醛中保存。將制成的眼杯取出，杯口朝向操作者，以視神經為界，垂直于視盤兩側髓線方向，用銳利刀片將眼杯分為兩部分，再將其切成數塊，每塊約3mm×3mm大小，用10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋,切片（厚度為4μm），分別作HE染色與免疫組化。免疫組化染色判斷標準:以細胞質中見到棕黃色顆粒為陽性。取對照組未經染色的石蠟切片，用同樣方法進行染色作為正常對照組；取刪除一抗，用PBS代替，其余染色方法相同的切片作為陰性對照組；取結腸癌患者組織石蠟切片，用同樣方法進行染色作為陽性對照組。染色均使用同一批試劑、同一試劑盒抗體及同一人完成。染色結果半定量分析:組織切片中胞質染為淡黃色至棕褐色者為陽性細胞標志，染色強度以呈現的染色特性（染色深淺需與背景著色相對比）計分:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比即一個視野內染色陽性的血管數占總血管數的百分比:0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。每張切片隨機取2 個400倍視野,每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比計分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積，綜合計算每眼免疫組化平均分數。

2.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，所有數據均采用均數±標準差（±s ）表示，進行方差分析、Dunnett檢驗、LSD法，以孕＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 兔視網膜靜脈阻塞模型建立 模型組9只家兔（18眼）中，經眼底血管造影（FFA）證實，視網膜靜脈成功封閉，13只眼一次造模成功，有5只兔眼光凝封閉不完全，于造模術后第二天再通，再次行激光光凝封閉，經FFA證實視網膜靜脈成功封閉。造模成功次日，即阻塞靜脈近端、遠端擴張，血管走行紊亂，表層網膜少量出血（圖1，見封底）。造模2天后，網膜血管可見火焰狀出血（圖2，見封底）。網膜光凝術后1天，有5眼中網膜側支循環(huán)形成，補充光凝激光。18只眼均始終未見虹膜新生血管出現。

正常家兔眼組織切片，光鏡下視網膜各層次結構整齊，網膜血管位于視網膜表面或神經節(jié)細胞淺層，顆粒層細胞排列緊密（圖3，見封底）。模型組家兔眼組織切片，光鏡觀察細胞層次結構混亂，內層視網膜靜脈淤血，廣泛水腫，血管內皮細胞壁損傷，伴有神經纖維層空泡（圖4，見封底）。

3.2 免疫組化結果

3.2.1 空白對照組網膜PDGF-C表達 PDGF-C特異性染色陽性表達在細胞漿，呈棕黃色，細胞核不著色（陽性對照組，圖5，見封底），陰性對照組中未見網膜組織著色（圖6，見封底），正常視網膜組織中主要分布在神經節(jié)細胞、神經纖維層，內外界膜、血管內皮細胞幾乎不著色（圖7，見封底）。

3.2.2 模型組網膜PDGF-C表達 RVO家兔模型組造模1周后，家兔網膜組織中PDGF-C表達分布與正常家兔幾乎相同，但染色強度和密度有所增強，血管內皮細胞出現少許的淡黃色弱染色（圖8，見封底）；造模2周后，表達增強，陽性表達細胞數明顯增加，血管內皮細胞染色顆粒顯著加深，呈棕褐色強著色（圖9～10，見封底）；造模4周后，PDGF-C蛋白表達減弱，血管內皮細胞染色變淡，顆粒呈棕黃色（圖11，見封底）。

3.3 各組家兔視網膜PDGF-C表達 與空白對照組比較，1周、2周及4周模型組差異具有統計學意義（孕＜0.01）。2周模型組與1周、4周模型組比較，差異具有統計學意義（孕＜0.01），而1周模型組與4周模型組比較，孕=0.713，見表1。

表1 各組家兔視網膜PDGF-C表達（pg/mL±s）

表1 各組家兔視網膜PDGF-C表達（pg/mL±s）

注:與空白對照組比較，△孕＜0.01；與2周模型組比較，*孕＜0.01；PDGFC:血小板源性生長因子C

4 討論

RVO后期出現的黃斑水腫、玻璃體出血、高眼壓等嚴重危害視力的并發(fā)癥多由眼內新生血管引起，研究[4]表明，抗新生血管的治療能夠抑制血管新生，減少并發(fā)癥，提高患者視力。當前研究認為，血管生成因子與血管抑制因子失衡是新生血管形成的主要機制。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促進血管新生最重要的誘導因子[1]，近年來應用于臨床的以VEGF或其信號通路的相關環(huán)節(jié)為治療靶點的抗VEGF藥物獲得較好療效，而在臨床中出現應用抗VEGF治療后視力沒有上升的無應答現象，可能原因為抗VEGF藥物只能抑制VGEF依賴通路的信號傳導，而非VGEF依賴促進新生血管生長的通路未被抑制，故可發(fā)生無應答現象。PDGF-C不僅能對同為血管生成因子的VEGF具有促進作用，同時可單獨促進新生血管生成[5]，故推測PDGF-C抑制劑可能在這一過程里發(fā)揮重要的作用。

PDGF家族成員包括PDGF-A、PDGF-B、PDGFAB、PDGF-C、PDGF-D。PDGF-C是PDGF家族近十余年新發(fā)現的成員，是一種多亞基蛋白，共有345個氨基酸殘基。研究發(fā)現，PDGF-C在新生血管形成中發(fā)揮重要作用。PDGF-C能通過旁分泌或自分泌方式促進周細胞、細胞外基質和血管平滑肌細胞增生、遷移與趨化，還可直接作用于血管內皮細胞，而這些在新生血管形成過程中起到重要的作用[6]。研究發(fā)現，PDGF-C在體內的活性形式PDGF-CC可通過上調VGEF、PDGF-BB6及基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）[7]，釋放促血管生成因子，又可通過促巨噬細胞游走，調節(jié)糖原合成酶激酶類3β（GSK-3β）磷酸化[8]促進眼內新生血管生成；而阻滯PDGF-CC后可抑制上述因子的表達[8]。

Tang等[8]研究表明，PDGF-C在眼內呈高表達，Li等[2]研究發(fā)現PDGF四個家族成員皆可在成熟RPE中表達，而PDGF-C的mRNA表達水平是PDGF-A 和PDGF-B的100倍。在本實驗中，我們發(fā)現正常視網膜組織中神經節(jié)細胞、神經纖維層、內外界膜皆發(fā)現PDGF-C蛋白陽性表達，血管內皮細胞幾乎不著色，在RVO模型組視網膜組織中其表達皆有明顯提高。Hou等[6]發(fā)現在應用激光建造的脈絡膜新生血管（choroidalneovascularization，CNV）模型中PDGF-CC呈現高表達，并且在進一步的研究中發(fā)現與激光治療后注射VEGF中和抗體相比，每眼玻璃體腔單次注射2μg PDGF-CC中和抗體在不同時間皆能減少CNV病變區(qū)域（n=8，孕＜0.05），且能上調 PDGF/ PDGFR的抑制劑TNF-α；進一步研究表明激光治療后予玻璃體或視網膜下間隙注射 PDGF-CC shRNA能使PDGF-CC表達減少下降40%，并能明顯減少CNV區(qū)域（n=8，孕＜0.05或孕＜0.01）；并且熒光素造影顯示PDGF-CC中和抗體治療后CNV血管滲漏明顯減少，組織學檢測示纖維血管組織生成明顯減少；本實驗中發(fā)現PDGF-C在RVO模型視網膜組織中表達顯著增加，在第2周時最為明顯，內核層、神經節(jié)細胞表達增強，陽性細胞數增加，尤其血管內皮細胞染色顆粒顯著加深，呈棕褐色強著色，在第4周時，PDGF-C表達明顯減弱，我們認為這與健康家兔自我修復能力強，側支循環(huán)形成速度快有關。李芳等[9]模擬缺氧環(huán)境體外培養(yǎng)hRPE細胞，采用逆轉錄PCR與ELISA法檢測PDGF mRNA和蛋白表達，采用MTT法檢測hRPE細胞增生率，研究發(fā)現缺氧能促進PDGF的表達，PDGF表達上調可顯著促進hRPE細胞增生。本研究中人為造成家兔視網膜組織缺血缺氧狀態(tài)，結果顯示缺血區(qū)域的視網膜組織PDGF-C蛋白表達明顯增加。

動物模型是人類研究疾病的重要實驗方法和手段，國內外眼科學者利用RVO動物模型進行了諸多研究，為人類認識、治療及預防RVO提供了重要的參考資料。盡管家兔動物模型也出現視網膜出血、水腫、血管迂曲、微血管瘤、熒光素滲漏及無灌注區(qū)等RVO典型的臨床與病理改變，但其眼底改變與臨床RVO患者并非完全相同。如實驗性RVO 1～2周即可產生致密毛細血管簇，形成側支循環(huán)，這與臨床RVO不一致，臨床RVO患者眼底血管滲漏持續(xù)數月甚至數年之久，這種差異可能原因:臨床RVO患者大多為中老年人，常伴有高血壓、動脈硬化等全身性疾患，其視網膜血管及循環(huán)功能常處在病理狀態(tài)，這種病態(tài)基礎可促進并加重RVO病情發(fā)展，而實驗所用家兔本身健康，眼底血管無異常病理改變，血管突然阻塞可迅速產生側支循環(huán)進行代償修復，故評估RVO動物模型療效要充分考慮側支循環(huán)建立的因素。

本實驗結果提示，模型組PDGF-C蛋白表達明顯增加，1周、2周及4周模型組與空白對照組相比差異具有統計學意義（孕＜0.01）。結果表明，缺血區(qū)域視網膜PDGF-C有不同程度的表達，具有一定的時間相關性，其中以血管內皮細胞中表達最強。由此推測PDGF-C可能參與視網膜新生血管的形成，介入視網膜靜脈阻塞病情發(fā)展。

［1］Zhao S，Huang L，Wu J，et al.Vascular endothelial growth factor upregulates expression of annexin A2 in vitro and in a mouse model of ischemic retinopathy［J］.Mol Vis，2009， 15:1231-1242.

［2］Li R，Maminishkis A，Wang FE，et al.PDGF-C and-D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（12）:5722-5732.

［3］盧海，張惠蓉.兔視網膜靜脈阻塞眼視網膜新生血管組織中血管內皮生長因子mRNA的表達［J］.中華眼底病雜志，2001，17（1）:5-7.

［4］黎曉新.眼內抗血管生成藥物臨床應用的利與弊［J］.中華眼科雜志，2012，48（l0）:870-873.

［5］Lee C，Zhang F，Tang Z，et al.PDGF-C:a new performer in the neurovascular interplay［J］.Trends Mol Med，2013，19 （8）:474-486.

［6］Hou X，Kumar A，Lee C，et al.PDGF-CC blockade inhibits pathological angiogenesis by acting on multiple cellular and molecular targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107 （27）:12216-12221.

［7］Wagsater D，Zhu C，Bjorck HM，et al.Effects of PDGF-C and PDGF-D on monocyte migration and MMP-2 and MMP-9 expression［J］.Atherosclerosis，2009，202（2）:415-423.

［8］Tang Z，Arjunan P，Lee C，et al.Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation［J］.J Exp Med，2010，207:867-880.

［9］李芳，李敏，邢怡橋，等.缺氧及小干擾RNA轉染對人RPE細胞增生及血小板源性生長因子-BB表達的影響［J］.中華實驗眼科雜志，2014，32（6）:525-530.

（收稿:2015-12-20 修回:2016-03-02）

Expression of Platelet Derived Growth Factor C in the Retina of Rabbit with Retinal Vein Occlusion

FENG Yanbing1,QIAN Ping1,ZHU Jieyun2,WENG Wenqing1,CHEN Hongming1.1 Jiaxing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiaxing(314001),China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)，China

ObjectiveTo observe the expression of platelet-derived growth factor-C（PDGF-C）in the retina of rabbits with retinal vein occlusion（RVO）,and to investigate the effect of PDGF-C in RVO and the possible mechanism in the pathogenesis of retinal neovascularization.MethodsThe RVO of rabbit model was established with argon laser photocoagulation.After the 1st week,2ed week,and 4th week,the rabbits were sacrificed to observe the pathological changes by H-E staining and the expression of PDGF-C protein by immunohistochemistry.ResultsCompared with control group,the expression of PDGF-C protein in RVO rabbit model was significantly higher after the 1st,2 nd,and 4th week,with a statistically significant difference（4.833 1.835 pg/mL,10.500 1.634 pg/mL,5.167 1.835 pg/mL vs 2.167 0.408 pg/mL,孕＜0.01）.A significant difference in the expression of PDGF-C protein was found between 2nd week and 1st and 4th week（孕＜0.01）,but there was no significant difference between 1st week and 4th week（孕=0.713）.ConclusionPDGF-C is highly expressed in vascular endothelial cells of rabbits with RVO,indicating that it may play an important role in the development of RVO,and that its expression level has a certain time correlation with retinal ischemia.

rabbit;retinal vein occlusion;PDGF-C;protein

浙江省嘉興市科技計劃項目（No.2015c23020）

1浙江省嘉興市中醫(yī)院眼科（馮燕兵、翁文慶、陳紅明）、病理科（錢萍）（嘉興 314001）；2浙江中醫(yī)藥大學（杭州310053）

翁文慶，Email:wengwenq@163.com